Detección de extendida

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12022 (2023) Citar este artículo

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La Escherichia coli patógena extraintestinal (ExPEC), productora de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), causa infecciones humanas graves debido a su virulencia y perfiles de resistencia a múltiples fármacos (MDR). Caracterizamos 144 cepas ExPEC (recolectadas de un instituto terciario de cáncer) en términos de espectro de susceptibilidad a los antimicrobianos, variantes de ESBL, patrones de factores de virulencia (VF) y clasificación de filogrupos de Clermont. Los ensayos desarrollados de amplificación de polimerasa recombinasa múltiple y de amplificación dependiente de helicasa termófila (tHDA) para la detección de blaCTX-M, blaOXA, blaSHV y blaTEM, respectivamente, se validaron utilizando resultados de secuenciación por PCR. Todos los aislados de ESBL-ExPEC portaban genes blaCTX-M con la siguiente frecuencia de prevalencia de variantes: blaCTX-M-15 (50,5%) > blaCTX-M-55 (17,9%) > blaCTX-M-27 (16,8%) > blaCTX-M. -14 (14,7%). El ensayo de amplificación de polimerasa recombinasa múltiple tuvo una sensibilidad del 100 % y una especificidad para blaCTX-M, blaOXA, blaSHV, mientras que tHDA tuvo una sensibilidad del 86,89 % y una especificidad del 100 % para blaTEM. Los genes de FV mostraron la siguiente frecuencia de prevalencia: traT (67,4%) > ompT (52,6%) > iutA (50,5%) > fimH (47,4%) > iha (33,7%) > hlyA (26,3%) > papC (12,6%) > cvaC (3,2%), en aislados ESBL-ExPEC que pertenecían a los filogrupos A (28,4%), B2 (28,4%) y F (22,1%). La distribución de traT, ompT y hlyA y el filogrupo B2 fueron significativamente diferentes (P <0,05) entre los aislados ESBL-ExPEC y no ESBL-ExPEC. Por lo tanto, estos ensayos de amplificación de genes de resistencia isotérmica sin equipo contribuyen al tratamiento y control efectivo de ExPEC virulentos, especialmente las cepas de resistencia a los antimicrobianos.

Las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) en enterobacterias están clasificadas por la Organización Mundial de la Salud como la causa más crítica de resistencia a los antimicrobianos (RAM), lo que requiere el descubrimiento de nuevos antibióticos1. Además, la mayoría de las enterobacterias productoras de BLEE también son multirresistentes (MDR), lo que dificulta el tratamiento2. La Escherichia coli patógena extraintestinal (ExPEC) es un importante organismo productor de BLEE que, además del intestino, infecta el tracto urinario, el torrente sanguíneo, meningitis y heridas y causa sepsis. La RAM asociada a BLEE en ExPEC no solo se disemina en entornos de atención médica sino también en infecciones adquiridas en la comunidad3. El aumento global de cepas ESBL-ExPEC está provocando pérdidas clínicas y económicas similares en magnitud a las causadas por la patógena E. coli. A diferencia de E. coli patógena intestinal o E. coli comensal, definir el origen o reservorio primario de ExPEC es el mayor desafío en su tratamiento4. Además, la influencia de los genes de la resistencia a los antimicrobianos y de los factores de virulencia (FV) en la patogenicidad de ExPEC se ha convertido en una grave preocupación mundial. Por lo tanto, los investigadores se basan principalmente en el genotipado ExPEC para explorar la asociación entre los genes AMR, la FV y su distribución filogenética.

La distribución de E. coli productora de BLEE (ESBL-E coli) en infecciones extraintestinales es diversa y varía entre las diferentes regiones geográficas. La propagación clonal de E. coli ST131 (asociada con infecciones ExPEC, particularmente infecciones del tracto urinario y del torrente sanguíneo) contribuyó a la diseminación global del clon MDR5. Entre los genes BLEE, el blaCTX-M-15 es altamente prevalente, seguido de los genes CTX-M, TEM, SHV, PER, VEB, GES, BES, TLA y OXA6. La E. coli comensal en bovinos, cerdos y pollos sanos sirve como reservorio de genes de resistencia a los antimicrobianos7. La prevalencia de los genes CTX-M es mayor en E. coli uropatógena (UPEC) que en los aislados comensales de voluntarios sanos8. Además, las BLEE productoras de Enterobacterales (ESBL-Enterobacterales) pueden colonizar a largo plazo (> 12 meses) como microbiota intestinal9, lo que aumenta la propagación de la resistencia a los antimicrobianos de ESBL en un sistema de salud determinado, incluidos los seres humanos, los animales y el medio ambiente10. La presencia generalizada de genes BLEE en infecciones sistémicas también afecta significativamente los resultados terapéuticos y de mortalidad. El Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) recomienda la detección fenotípica y las pruebas de confirmación para la producción de BLEE como parte del tratamiento clínico habitual de las infecciones microbianas11. Sin embargo, los métodos genotípicos de detección de BLEE son más ventajosos para el manejo epidemiológico y ayudan a superar los desafíos asociados con la variación de la expresión fenotípica12.

Según la clasificación molecular de Ambler, las BLEE son serina β-lactamasas que comprenden tres genes importantes de clase A (blaCTX-M, blaTEM y blaSHV) y un gen blaOXA de clase D. Recientemente, se han aplicado ampliamente varias técnicas isotérmicas de amplificación de ácidos nucleicos recientemente descubiertas, que no requieren costosas máquinas de ciclado térmico, para la detección rápida y sencilla de genes de RAM13. En 2021, se desarrolló un ensayo de flujo lateral de amplificación de polimerasa recombinasa (RPA) múltiplex rápido a simple vista de 10 minutos para detectar los tres genes comunes de BLEE (blaCTX-M, blaOXA y blaSHV)14. Sin embargo, el uso de enzima recombinasa diseñada a partir de cepas de E. coli K12 o BL21 (que portan su propio gen blaTEM) resultó ser un gran revés; el uso de estos kits de RPA estuvo plagado de reactividad cruzada y resultados falsos positivos15. La técnica de amplificación dependiente de helicasa, como RPA, utiliza un par de cebadores para amplificar un objetivo específico de ADN/ARN a una temperatura determinada. Para desenrollar el ADN bicatenario y generar un nuevo amplicón, el kit RPA (TwistDx) utiliza recombinasa y ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena (Sau polimerasa), mientras que el kit IsoAmp® II Universal tHDA (New England Biolabs) emplea una helicasa termoestable Tte. -UvrD de Thermoanaerobacter tengcongenesis y ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus (Bst-ADN polimerasa)16. Las condiciones óptimas de amplificación para RPA y tHDA son 37–42 °C durante 20–40 min y 60–65 °C durante 90–120 min, respectivamente17. Tanto RPA como tHDA son ensayos portátiles de detección de ácidos nucleicos ideales para su uso en lugares de atención o entornos de campo con recursos limitados13.

La patogenicidad de ExPEC está influenciada por varios genes de FV, con amplias funciones, que van desde la colonización bacteriana hasta la virulencia18. Además, la mayoría de los genes de FV están codificados por plásmidos, islas de patogenicidad (PAI)18,19 u otros elementos genéticos móviles18 que se transfieren horizontalmente a otras bacterias patógenas y no patógenas. E. coli se clasifica en ocho grupos filogenéticos (A, B1, B2, C, D, E, F y Clado I) utilizando la PCR cuádruplex más sencilla (que es menos compleja y más rápida que los métodos de tipificación de secuencias multilocus o de ribotipificación)20 . La asociación de BLEE, genes de FV y filogrupos se ha investigado tanto en ExPEC como en E. coli comensal. Milenkov et al., descubrieron que blaCTX-M-15 era el gen ESBL más prevalente en muestras de E. coli aisladas de una mujer embarazada sana de Madagascar. Además, el 90% de estos aislados pertenecían a los grupos filogenéticos A, B1 y C (que están asociados con el comensalismo y portan algunos genes VF implicados en la adhesión y la adquisición de hierro). Mientras que el 10% de estos aislados pertenecían a los grupos filogenéticos virulentos extraintestinales B2, D y F21. Se observó portador persistente a largo plazo (promedio de 3,5 meses) de enterobacterias ESBL (que pertenecían al filogrupo B2/D/F asociado a virulencia extraintestinal) en viajeros que visitaban áreas tropicales, 3 o más meses después de su regreso. Mientras que los filogrupos comensales asociados A/B1/E persistieron durante períodos de transporte más cortos (aproximadamente 0,5 meses)21. El filogrupo B2 de E. coli uropatógena (UPEC) exhibió una RAM máxima y portó seis FV22. Las ESBL-ExPEC portadoras de genes de FV, aisladas de infecciones del torrente sanguíneo, mostraron el siguiente orden de predominio de filogrupo: B2 (45,8%) > B1 (18,8%) > E (14,6%). Los genes ESBL blaCTX-M-15 y VF traT fueron los más predominantes23. E. coli, el patógeno más frecuente, sólo superado por los estreptococos del grupo B, que causa meningitis neonatal en infecciones de aparición temprana, pertenecía al filogrupo B2 extraintestinal; > 70% de esta cepa patógena de E. coli porta los genes kpsII, K1, neuC, iucC, sitA y vat. En cambio, E. coli obtenida de individuos sanos pertenecía a los grupos A y D; portan <27% de los genes de FV24,25.

Nuestro objetivo fue desarrollar ensayos de amplificación isotérmica para caracterizar genes ESBL (blaCTX-M, blaOXA, blaSHV y blaTEM) en cepas ESBL-ExPEC. La sensibilidad y especificidad de estos ensayos se validaron mediante secuenciación de nucleótidos. Estas plataformas isotérmicas simples se pueden establecer en entornos de bajos recursos para monitorear ESBL en todas las muestras clínicas. Además, caracterizamos y analizamos filogenéticamente los genes de FV (traT, ompT, iutA, fimH, iha, hlyA, papC y cvaC) encontrados en los aislados clínicos de ESBL-ExPEC. Identificar asociaciones entre los genes ESBL, los genes FV y los filogrupos ESBL-ExPEC es importante para mejorar la vigilancia global de la RAM, el tratamiento antibiótico dirigido y el control de infecciones.

De los 144 ExPEC aislados de diversas muestras extraintestinales, incluidas sangre, orina, pus, fluidos corporales y esputo, se identificaron 95 cepas de ExPEC ESBL y 49 no ESBL mediante el método de disco combinado indicado en la directriz CLSI11. Las 95 E. coli productoras de BLEE se sometieron a genotipado. Encontramos genes blaCTX-M (n = 95) solos o en combinación con los genes blaTEM (n = 40), blaOXA (n = 29) y blaSHV (n = 2) (Tabla complementaria S1). Además, 21 de 49 E. coli no productoras de BLEE analizadas fenotípicamente albergaban el gen blaTEM-1, mientras que en el resto no se observó ninguno de los genes blaTEM, blaOXA, blaSHV y blaTEM. Los resultados de la secuenciación por PCR de las variantes de CTX-M revelaron el siguiente orden de prevalencia: blaCTX-M-15 (50,5%) > blaCTX-M-55 (17,9%) > blaCTX-M-27 (16,8%) > blaCTX-M. -14 (14,7%). El blaSHV se encontró sólo en 2 aislamientos. El patrón de susceptibilidad a los antibióticos de las variantes ESBL-ExPEC más comunes (tipos CTX-M-15, CTX-M-27, CTX-M-14 y CTX-M-55) mostró una resistencia del 100% a cefotaxima y cefdinir como se describe en la Tabla 1. Se observó el siguiente orden (alto-bajo) en MDR hacia ceftriaxona, cefepima, ciprofloxacina, ceftazidima, levofloxacina y gentamicina: aislados blaCTX-M-15 > aislados blaCTX-M-55 > aislados blaCTX-M-27.

La concentración óptima de cebadores blaCTX-M, blaOXA y blaSHV requerida en la reacción RPA múltiple fue 0,2 µM CTX-M, 0,1 µM OXA y 0,1 µM SHV (Fig. 1A), respectivamente. Todos los productos se amplificaron a 37–39 °C (Fig. 1B) a 25–30 min (Fig. 1C). La concentración de plantilla de ADN que oscilaba entre 12,5 y 25 ng mostró las bandas aparentes de los 3 amplicones (Fig. 1D). El amplicón de blaSHV estuvo ausente a 41 ℃ y la duración de la incubación fue <25 min. Finalmente, se eligió como óptima la siguiente condición de reacción multiplex RPA: 37 °C durante 25 minutos utilizando 25 ng de ADN molde.

Optimización del ensayo RPA. La electroforesis en gel de agarosa muestra los amplicones blaCTX-M, blaOXA y blaSHV (A) cuando se utilizaron CTX-M 0,2 µM, OXA 0,1 µM, SHV 0,1 µM y CTX-M 0,2 µM, OXA 0,05 µM y SHV 0,05 µM; (B) a 37–41 °C; (C) a 10-30 min de incubación; y (D) a diferentes concentraciones de plantilla de ADN (1,5–25 ng) [M, marcador de 100 pb; C+, control de ADN positivo; C-, sin control de plantilla].

Se empleó tHDA en lugar de RPA para amplificar 111 pb de blaTEM. El amplicón blaTEM se observó a 65–67 °C (Fig. 2A), con una incubación de 30 a 90 minutos (Fig. 2B). Las concentraciones óptimas de plantilla de ADN y cebadores fueron de 50 a 100 ng (Fig. 2C) y de 0,025 a 0,05 µM, respectivamente (Fig. 2D). Se seleccionó como óptima la siguiente condición de tHDA: 65 °C durante 30 minutos utilizando 50 ng de ADN molde y cebadores 0,025 µM.

Optimización del ensayo tHDA. La electroforesis en gel de agarosa mostró los amplicones de blaTEM (A) a 59–67 °C; (B) entre 15 y 90 minutos; (C) a diferentes concentraciones de plantilla de ADN (0,05 a 100 ng); y (D) a diferentes concentraciones de cebadores (0,025–0,075 µM) [M, marcador de 100 pb; C+, control de ADN positivo; C-, sin control de plantilla].

Las plantillas de ADN se aislaron de la cepa clínica de E. coli ESBL120 que porta blaCTX-M, la cepa KP125 que porta blaOXA, la cepa EC137 que porta blaTEM y K. pneumoniae ATCC 700,603 que porta blaSHV. El LOD de los ensayos de RPA múltiple para los genes blaCTX-M, blaOXA, blaSHV (Fig. 3A-C) fue de 5 ng, 0,5 ng y 0,5 ng, respectivamente. La sensibilidad fue de 10 a 100 veces mayor que la del ensayo tHDA para blaTEM (LOD de 50 ng) (Fig. 3D).

(A – C) LOD para la detección de blaCTX-M, blaOXA y blaSHV mediante ensayo RPA; (D) LOD para la detección de blaTEM mediante tHDA; (E) Especificidad del ensayo RPA para los genes blaCTX-M, blaOXA y blaSHV; y (F) Especificidad del ensayo tHDA para el gen blaTEM [M, marcador de 100 pb; C+, control de ADN positivo; C-, sin control de plantilla].

Los amplicones estuvieron ausentes (Fig. 3E y F) en los ensayos RPA y tHDA del ADN de los siguientes organismos: E. coli ATCC 25,922, Proteus mirabilis ATCC 25,933, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27,853, Acinetobacter baumannii ATCC 19,606, Staphylococcus aureus ATCC 25,923 y Enterococcus s faecalis ATCC 29.212. Se produjo un amplicón de 214 pb a partir de ADN de K. pneumoniae ATCC 700.603, que contiene naturalmente blaSHV.

Un total de 95 ESBL-ExPEC y 49 no ESBL-ExPEC se sometieron a ensayos multiplex de RPA y tHDA. Los resultados de los genes blaCTX-M, blaOXA y blaSHV de los ensayos multiplex de RPA coincidieron con los resultados de la secuenciación por PCR que mostraron una sensibilidad del 100 % (IC del 95 % = 96,19–100 %, 88,06–100 %, 15,81–100 %, respectivamente). , 100% de especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) (IC 95%: 92,75–100%, 96,84–100% y 97,44–100%, respectivamente) (Tabla 2). Mientras que el ensayo tHDA mostró ocho muestras falsamente negativas del gen blaTEM con un rendimiento de 86,89 % (IC 95 % = 93,28–100), 100 % (IC 95 % = 83,41–96,13 %), 100 % (IC 95 % = 28,93–45,42 %) y 91,21% (IC 95% = 77,37–92,78%) de sensibilidad, especificidad, VPP y VPN, respectivamente. La precisión de la identificación de los genes blaCTX-M, blaOXA y blaSHV fue del 100 %, y la del gen blaTEM fue del 94,44 %.

En los 95 aislados clínicos de ESBL-ExPEC, los genes de FV exhibieron el siguiente orden en frecuencia: traT (67,4%) > ompT (52,6%) > iutA (50,5%) > fimH (47,4%) > iha (33,7%) > hlyA (26,3%) > papC (12,6%) > cvaC (3,2%), respectivamente (Tabla 3). Todos los genes de FV se distribuyeron entre las variantes de CTX-M, excepto papC y cvaC que no se encontraron en la variante CTX-M-27. El gen traT se encontró con frecuencia en CTX-M-15 (75%), CTX-M-14 (64,3%) y CTX-M-55 (76,5%). Mientras que el gen iha predominó en CTX-M-27 (70,6%). Los filogrupos más comunes entre las cepas ESBL-ExPEC incluyeron: A (28,4%), B2 (28,4%), F (22,1%). Los CTX-M-14, 15 y 55 (35,7%, 29,2% y 47,1%) predominaron en el filogrupo A, mientras que la mayoría de los CTX-M-27 pertenecían al filogrupo B2 (70,6%). Solo se encontraron variantes CTX-M-15 y CTX-M-55 en los raros filogrupos B1 y E, respectivamente.

Los aislados ESBL-ExPEC y no ESBL-ExPEC portaban predominantemente traT y ompT, respectivamente (Tabla 4). Sorprendentemente, cvcC estuvo ausente en nuestros aislados sin BLEE. La asociación de traT, ompT y hlyA fue significativamente diferente (P <0,05) entre los aislados ESBL-ExPEC y no ESBL-ExPEC. El predominio de filogrupo fue el siguiente: filogrupo B2 (35,4%) > A (23,6%) > F (19,4%). Las ESBL-ExPEC estuvieron dominadas por los filogrupos A y B2, mientras que las no ESBL-ExPEC estuvieron dominadas por el filogrupo B2. Sólo el filogrupo B2 fue significativamente diferente entre los grupos ESBL y no ESBL (P <0,05). El filogrupo Clados I estuvo ausente en todos los aislados clínicos. El análisis de varianza mediante la prueba de Friedman reveló una diferencia significativa en la distribución del gen FV (P = 0,000). Tres genes VF (hlyA, iha y ompT) se distribuyeron de manera diferente entre los filogrupos (Tabla 5). El análisis por pares del filogrupo mostró que hlyA se asoció con el filogrupo A y iha se asoció con los filogrupos F, A y B2 (P <0,05). Mientras que ompT se asoció con los filogrupos B2 y F (P <0,05).

ExPEC es una causa importante de morbilidad y mortalidad tanto en infecciones adquiridas en hospitales como en la comunidad. Aparte de los factores epidemiológicos, es probable que la adquisición de FV y RAM contribuya a la pandemia mundial de linajes ExPEC4,26. Además, la transferencia horizontal de genes BLEE mediada por plásmidos se produce fácilmente entre especies, lo que provoca una infección generalizada6. La evidencia acumulada sugirió que las FV ayudan a los patógenos gastrointestinales a superar a la microbiota comensal y perjudicar la inmunidad del huésped al inducir colonización, resistencia e invasión27.

ESBL-Enterobacteriaceae, especialmente E. coli, fue uno de los aislamientos más frecuentes en muestras de infección del torrente sanguíneo recolectadas en un centro de oncología pediátrica28. La E. coli MDR de pacientes con cáncer neutropénico febril mostró una alta resistencia a ampicilina, cefepima, ceftriaxona y cefradina29. Aquí, todos los ESBL-ExPEC aislados de pacientes con cáncer portaban blaCTX-M, mostrando el siguiente predominio: grupo blaCTX-M1 (68,4%; 50,5% blaCTX-M-15 y 17,9% blaCTX-M-55) > grupo blaCTX-M9 ( 31,5%; 16,8% blaCTX-M-27 y 14,7% blaCTX-M-14). Se observó MDR en todas las variantes de CTX-M. Eran resistentes a ceftriaxona, cefepima, ciprofloxacina, ceftazidima, levofloxacina y gentamicina. De manera similar, los ESBL-ExPEC (de hospitales terciarios de Tailandia) portaban predominantemente blaCTX-M1 (71,23%) y blaCTX-M9 (38,95%)30. La cepa patógena global de E. coli ST 131 alberga blaCTX-M-15 (67,6%), blaCTX-M-27 (20,6%) y blaCTX-M-14 (11,8%)31. A nivel mundial, el gen blaCTX-M-15 es el gen ESBL frecuentemente reportado, especialmente en infecciones del torrente sanguíneo y del tracto urinario23,32,33,34. El blaCTX-M-55 está presente en la mayoría de E. coli aisladas de muestras fecales y de carne de cerdo14,35.

Existen varios ensayos para genotipificar genes de BLEE: (1) Kanokudom et al. 14 desarrollaron un ensayo RPA múltiplex rápido a simple vista para detectar blaCTX-M, blaOXA y blaSHV en aislados de E. coli de cerdo. Los amplicones se visualizaron en una tira de matriz impresa cromatográfica de hibridación de etiquetas monocatenarias (STH-PAS, una tira de ensayo de flujo lateral comercial); (2) Higgins et al.,36 establecieron un ensayo portátil de amplificación isotérmica mediada por bucle de escisión de endonucleasa con cebador de bucle (escisión de endonucleasa con cebador de bucle-LAMP) para detectar blaCTX-M-1 y blaCTX-M-15 en heces porcinas. aislados de E. coli; y (3) Wang et al. desarrollaron un ensayo de PCR en tiempo real basado en sondas para detectar blaCTX-M, blaTEM y blaSHV en aislados de E. coli de pollos de engorde37.

Aquí, desarrollamos los siguientes ensayos isotérmicos para detectar genes ESBL comunes: (1) un ensayo RPA múltiple para detectar genes blaCTX-M, blaOXA y blaSHV; y (2) un ensayo tHDA para detectar el gen blaTEM. Los amplicones se visualizaron mediante el método de electroforesis en gel de agarosa, que es una técnica económica y ampliamente utilizada en el laboratorio molecular general. Estas plataformas isotérmicas simples para la amplificación de ácidos nucleicos utilizan solo un par de cebadores (como la PCR) y los instrumentos de calentamiento comúnmente disponibles. Además, en comparación con otras plataformas isotérmicas, el kit RPA (kit TwistAmp Basic) es un reactivo liofilizado altamente estable con una larga vida útil38. Los gránulos liofilizados en el kit RPA son estables durante al menos un año cuando se almacenan a temperaturas inferiores a -15 °C o entre 2 y 8 °C, y hasta 6 meses a temperatura ambiente (22 a 28 °C)39. Sin embargo, el kit RPA es ligeramente más caro (~ $4,3 USD) que otros ensayos de amplificación, como PCR y LAMP (patentes vencidas)38. Además, la patente de RPA expirará en 202340, lo que dará paso al desarrollo de una nueva fórmula interna de RPA rentable que permitirá sus aplicaciones a gran escala.

Las composiciones de nucleótidos y la longitud de los cebadores afectan la temperatura de hibridación óptima y el tiempo de incubación en reacciones RPA múltiples. En este caso, las altas temperaturas (que conducen a una mala unión de los cebadores) o los cortos tiempos de incubación no produjeron amplicones de blaSHV, probablemente porque los cebadores de blaSHV tienen contenidos de GC más bajos y longitudes más cortas que los cebadores blaCTX-M y blaOXA. Las concentraciones altas de cebador aumentan la posibilidad de que se formen dímeros de cebador y amplicones no específicos en reacciones RPA múltiples, mientras que las concentraciones bajas pueden conducir a rendimientos bajos. Por lo tanto, un buen diseño de cebadores y una optimización exhaustiva son fundamentales para una amplificación isotérmica multiplexada eficaz41. El LOD de nuestro ensayo de electroforesis en gel RPA múltiple para detectar los genes blaCTX-M, blaOXA y blaSHV fue ligeramente inferior al del ensayo de flujo lateral (LFA) múltiplex RPA anterior14. Los amplicones de RPA deben purificarse antes de cargarlos en el gel de agarosa para eliminar los contaminantes proteicos42. Este paso de purificación posterior a la amplificación de RPA provoca la pérdida de amplicones. Además, la sensibilidad de detección mediante electroforesis en gel de agarosa depende de la eficacia de varios pasos (precarga, prefabricación y postinción)43. Por lo tanto, la purificación posterior a la amplificación de RPA es un inconveniente importante para la detección por electroforesis en gel44. Existen varios métodos para la purificación de productos RPA, incluida la desnaturalización por calor (65 °C o 95 °C durante 10 minutos), el tratamiento con dodecilsulfato de sodio, la digestión con proteinasa K, la sedimentación de proteínas mediante centrifugación de alta velocidad y la purificación utilizando kits comerciales de purificación de ADN44. Aunque la electroforesis en gel de agarosa es un método común para la visualización de productos de amplificación, requiere mucho tiempo debido a los pasos de preparación del gel, electroforesis, tinción del gel y obtención de imágenes. Estas limitaciones se pueden sortear en el futuro mediante el uso de varios métodos de detección internos (que emplean floculación en puente, SYBR green I o ensayos de flujo lateral) para desarrollar una solución rentable, simple, sin equipo, rápida y sin necesidad de equipo. ensayo ocular para detectar los genes deseados39,44.

La evaluación del LOD del ensayo tHDA para blaTEM requirió entre 10 y 100 veces la concentración de plantilla utilizada en los ensayos de RPA para los genes blaCTX-M, blaOXA y blaSHV. Las condiciones de funcionamiento de tHDA a alta temperatura (60–65 ° C) pueden afectar la eficiencia de unión del cebador; sin embargo, la especificidad podría ser mayor que la amplificación isotérmica mesófila38. Además, en comparación con RPA y PCR, utilizamos concentraciones de cebador más bajas (0,1–1 μM frente a 75–100 nM) para el ensayo tHDA. El amplicón tHDA generalmente tiene una longitud <150 nucleótidos, debido a la procesividad de la helicasa que limita la capacidad de multiplexación41,45. Nuestro ensayo de RPA múltiplex mostró una sensibilidad y especificidad del 100 % para los genes blaCTX-M, blaOXA y blaSHV. Sin embargo, tHDA tuvo una sensibilidad del 86,89% y una especificidad del 100% para blaTEM. El LOD más alto y las concentraciones de cebador más bajas utilizadas pueden haber causado que el ensayo tHDA tenga una sensibilidad más baja, en comparación con el ensayo RPA. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir para muestras con baja cantidad y calidad de ADN (ADN viejo/degradado).

Las cepas ExPEC, en comparación con las cepas comensales de E. coli, tienen una estructura filogenética compleja y VF diversos4. Las cepas ExPEC, como E. coli uropatógena (UPEC), E. coli meningitis neonatal (NMEC), E. coli asociada a sepsis (SEPEC) y E. coli patógena aviar (APEC), tienen varias FV. Los ExPEC VF, como adhesinas, toxinas y adquisición de hierro, lipopolisacáridos, cápsulas e invasinas, facilitan su colonización e infección sistémica. La UPEC causa predominantemente infección del tracto urinario y bacteriemia secundaria18. Aquí, tres genes de FV (traT, ompT y hlyA) se asociaron significativamente con cepas ESBL-ExPEC. traT fue el más prevalente, presente en las variantes CTX-M-14, 15 y 27. Otros genes prevalentes de FV fueron la adquisición de aerobactina (iutA) y adhesinas (fimH e iha). Mientras que unos pocos cvaC existían solo en nuestros aislados clínicos ESBL-ExPEC. El gen de resistencia sérica traT, que inhibe la vía clásica de la actividad del complemento, está presente en todos los patotipos con mayor prevalencia en la UPEC46,47,48. La proteína de la membrana externa (ompT) asociada con la UPEC permite la supervivencia intracelular y la evasión de la defensa del huésped. La hemolisina A (hlyA) es una toxina de lisis de membrana presente en las cepas UPEC. La adhesina afimbrial (afa) se encontró asociada con la mortalidad por bacteriemia23.

Sólo el filogrupo B2 fue significativamente diferente entre ESBL-ExPEC y no ESBL-ExPEC. De manera similar, los aislados de E. coli resistentes a cefalosporinas de espectro extendido que pertenecen al filogrupo B2 portaban genes AmpC mediados por plásmidos y/o BLEE; blaCTX-M-15, blaCTX-M-14, blaCTX-M-55 fueron los más prevalentes49. Los filogrupos A y F son cepas comensales y asociadas a aves50, respectivamente. Son el segundo y tercer filogrupo abundante en nuestros aislados de E. coli. Además, sólo tres genes de FV (ompT, iha y hlyA) se distribuyeron de manera diferente entre los filogrupos, especialmente en B2, F y A. El filogrupo B2 fue el más prevalente en los aislados clínicos (de muchas infecciones sistémicas) y tuvo una mayor prevalencia. número de FV que otros filogrupos4. Aunque el filogrupo F fue menos virulento que el B2, se ha establecido su importancia clínica en la mediación de la RAM en ExPEC49,51,52.

En conclusión, la mayoría de las ESBL-ExPEC poseían un patrón MDR perteneciente al filogrupo B2 y portaban más genes VF. TraT, ompT y hlyA se encontraron asociados con cepas ESBL-ExPEC. La relación de los genes VF se demostró por primera vez en filogrupos con diversos ompT, iha y hlyA. Los patotipos de E. coli deberán caracterizarse en el futuro. La identificación y caracterización de los genes AMR, FV y sus patotipos y el análisis filogenético pueden contribuir al desarrollo de nuevas estrategias para el tratamiento de la infección sistémica mediada por E. coli. Además, nuestros ensayos multiplex RPA y tHDA, presentados aquí, son simples, rápidos y confiables para detectar los genes de BLEE más comunes. Estos ensayos son beneficiosos para diseñar estrategias de terapia dirigida en entornos de bajos recursos (utilizando equipos de calefacción comunes) y control epidemiológico.

Entre febrero de 2017 y septiembre de 2018 se recogieron un total de 144 aislados clínicos de E. coli de diversas muestras, incluidas sangre, orina, pus, fluidos corporales y esputo, de un instituto terciario de cáncer en Bangkok (Tailandia). Todos los aislados se conservaron en leche desnatada. a − 80 °C hasta su uso.

El tamaño de la muestra utilizado aquí se calculó utilizando el método de Buderer,53 que ayuda a evaluar la sensibilidad y especificidad de las pruebas de diagnóstico con un intervalo de confianza del 95%. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Nacional del Cáncer de Tailandia (número de certificado 020/2562).

Se seleccionaron noventa y cinco aislados de ESBL-ExPEC y cuarenta y nueve aislados de ESBL-ExPEC de forma consecutiva y no duplicados a partir de muestras clínicas mediante detección fenotípica de ESBL. Su susceptibilidad antimicrobiana a diversos antibióticos, incluidos amikacina (30 µg), gentamicina (10 µg), ampicilina (10 µg), amoxicilina/ácido clavulánico (20/10 µg), ceftazidima (30 µg), cefotaxima (30 µg), cefdinir (5 µg), cefepima (30 µg), ciprofloxacino (5 µg), ceftriaxona (30 µg), doripenem (10 µg), ertapenem (10 µg), imipenem (10 µg), meropenem (10 µg), levofloxacino ( 5 µg) y piperacilina/tazobactam (1,25/23,75 µg)—se determinó mediante el método de difusión en disco. Las pruebas de confirmación de BLEE se realizaron mediante el método de disco combinado según las directrices del CLSI11. Se consideró que se producían BLEE cuando el tamaño de cualquiera de las zonas de inhibición de cefotaxima/ácido clavulánico (30/10 µg) o ceftazidima/ácido clavulánico (30/10 µg) era ≥ 5 mm en comparación con el de cefotaxima (30 µg) o ceftazidima. (30 µg).

Se aisló ADN de colonias puras de E. coli cultivadas en agar MacConkey mediante el método de ebullición. Brevemente, los aislados bacterianos se suspendieron en 400 µl de tampón Tris-EDTA (tampón TE), se mezclaron con vórtex y se hirvieron a 95 ° C durante 10 minutos. El sobrenadante se separó mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 5 min. El ADN se precipitó añadiendo 1/10 de volumen de NaOAc 3 M, pH 5,2 y 2 a 3 volúmenes de etanol absoluto enfriado y se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 minutos. El ADN bacteriano se lavó con etanol al 70%, se secó y se disolvió en 50 µl de tampón TE. El ADN se almacenó a -20 °C para su posterior amplificación.

Todos los aislados clínicos de E. coli se investigaron para detectar la presencia de genes ESBL (blaCTX-M, blaOXA, blaSHV y blaTEM). Además, se secuenciaron los genes para identificar las variantes. Las secuencias de cebadores y los tamaños de amplicones de cada gen ESBL se describen en la Tabla complementaria S2. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen total de 25 µL que comprendía 50 ng de ADN, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, 0,4 µM de cada cebador, 1 × tampón de reacción Taq estándar y 1,25 U de polimerasa Taq (New England Biolabs, REINO UNIDO). La amplificación de cada gen BLEE se realizó como se describió previamente54,55,56,57. El control positivo de blaTEM, blaCTX-M, blaOXA y blaSHV se derivaron de E. coli EC137 y K.pneumoniae KP125, respectivamente (amablemente proporcionado por el Prof. Visanu Thamlikitkul, Facultad de Medicina del Hospital Siriraj, Universidad Mahidol, Bangkok, Tailandia). Todos los productos de PCR se examinaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Los fragmentos amplificados fueron secuenciados (Bioneer Corporation, Corea del Sur) y alineados con la base de datos GenBank utilizando el programa BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) y Clustal Omega (https://www.ebi. ac.uk/Tools/msa/ustalo/), respectivamente.

Se utilizaron los cebadores RPA para los genes blaCTX-M, blaOXA y blaSHV descritos anteriormente (Tabla complementaria S3). La reacción RPA múltiple se realizó utilizando el kit de reacción TwistAmp Basic (TwistDx, Reino Unido). La mezcla maestra de RPA contenía 0,2 µM de cebadores blaCTX-M, 0,1 µM de cada uno de los cebadores blaOXA y blaSHV, 29,5 µL de tampón de rehidratación, 50 ng de plantilla de ADN y agua destilada estéril agregada para obtener un volumen final de 47,5 µL. La reacción se mezcló con vórtex y luego se transfirió a un tubo liofilizado y finalmente se mezcló con 2,5 µl de MgOAc 280 mM. La reacción se incubó a 37 °C durante 25 min. Para explorar las condiciones óptimas de las reacciones RPA múltiples para blaCTX-M, blaOXA y blaSHV, se probaron las siguientes condiciones: (a) dos conjuntos de concentraciones de cebadores CTX-M, OXA y SHV: 0,2, 0,1, 0,1 y 0,2 , 0,05, 0,05 µM; (b) tres temperaturas de reacción: 37 °C, 39 °C y 41 °C; y (c) cinco duraciones de incubación: 10, 15, 20, 25 y 30 min. Los amplicones de RPA se purificaron utilizando un kit de purificación por PCR GeneJet (Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.) y se detectaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

El gen blaTEM de E. coli (n.º de acceso MG515250.1) se utilizó para el diseño de cebadores utilizando el programa Primer3plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Las secuencias fueron las siguientes: cebador directo, 5′-TGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTAC-3'; cebador inverso, 5′-CCCTACGATCAAAGGCGAGTTACATGAT-3′. La reacción de tHDA se realizó en un volumen total de 50 µl utilizando el kit universal de tHDA IsoAmp® II (New England Biolabs, Inc., EE. UU.). El mezclador de reacción contenía tampón de recocido II 1X, MgSO4 4 mM, NaCl 40 mM, 3,5 µl de solución de dNTP IsoAmp®, 0,075 µM de cada cebador y 3,5 µl de mezcla de enzimas IsoAmp®. La reacción se cubrió con aceite mineral y se incubó a 67 °C durante 75 min. La condición de tHDA se optimizó variando la concentración del cebador (0,025, 0,050 y 0,075 µM), la temperatura (63 °C, 65 °C, 67 °C, 69 °C, 71 °C) y el tiempo de incubación (30, 45, 60 , 75 y 90 min). El amplicón tHDA de 111 pb se detectó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

El ADN molde de E. coli EC120, K. pneumoniae KP125, K. pneumoniae ATCC 700,603, E. coli EC137 que alberga los genes blaCTX-M, blaOXA, blaSHV y blaTEM, respectivamente, se diluyeron a 100, 50, 5, 0,5, Concentraciones de 0,05 ng/μL. El LOD se evaluó como la concentración de ADN más baja requerida para la producción de amplicones utilizando los ensayos multiplex RPA y tHDA optimizados (en este estudio). La especificidad también se evaluó utilizando ADN aislado de E. coli ATCC 25.922, K. pneumoniae ATCC 700.603, Proteus mirabilis ATCC 25.933, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27.853, Acinetobacter baumannii ATCC 19.606, Staphylococcus aureus ATCC 25.923 y Enterococcus faecalis ATCC. 29.212.

Los 144 aislados clínicos se examinaron para detectar la presencia de los genes blaCTX-M, blaOXA y blaSHV (ensayo multiplex RPA) y el gen blaTEM (ensayo tHDA). La sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivos y negativos se calcularon comparándolos con los resultados de la secuenciación de nucleótidos obtenidos utilizando el software estadístico fácil de usar MEDCALC® (https://www.medcalc.org/calc/diagnostic_test.php).

Ocho genes de virulencia, a saber. traT, ompT, iutA, fimH, hlyA, iha, papC y cvaC, que se asocian comúnmente con ExPEC, se caracterizaron mediante métodos de PCR múltiple. Se sintetizaron y clonaron comercialmente tres genes de control positivo (fimH, hlyA e iutA) en vectores GeneArt (Invitrogen, EE. UU.). Luego, los plásmidos recombinantes se transformaron en una célula competente DH5α utilizando Subcloning Efficiency™ DH5α Competent Cell (Invitrogen, EE. UU.). Los cebadores para estos tres genes de virulencia (diseñados aquí) y cinco conjuntos de cebadores para los genes traT, ompT, cvaC, iha y papC (descritos anteriormente) se tabulan en la Tabla complementaria S4. El primer grupo consta de fimH, hlyA e iutA, mientras que el segundo grupo comprende cvaC, iha, traT, ompT y papC. Una reacción total de 25 µl que comprende 1 × tampón de reacción Taq estándar y 1,5 U de polimerasa Taq (New England Biolabs, Reino Unido), 0,2 µM de cada conjunto de cebadores (directo e inverso), dNTP 0,2 mM, ~ 100 ng de plantilla de ADN y ultra- Se utilizó agua pura. La condición de PCR optimizada para genes de virulencia fue: desnaturalización inicial a 94 ℃ durante 15 min seguida de 29 ciclos a 94 ℃ durante 1 min, hibridación a 56 ℃ durante 1 min, extensión a 72 ℃ durante 1 min y extensión posterior a 72 ℃ durante 10 min. Todos los amplicones se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

La PCR cuádruplex se realizó dirigiéndose a arpA, chuA, yjaA y TspE4.C2 (Clermont et al.). Se llevó a cabo una PCR adicional como se describió anteriormente20 utilizando cebadores específicos para los grupos C, E y clados crípticos. Se ilustran los cebadores publicados anteriormente y el tamaño del amplicón (Tabla complementaria S5). Los filogrupos B1, B2 y F se asignaron en función de los resultados cuádruplex, mientras que se utilizaron cebadores específicos para diferenciar los filogrupos C, E y otros clados crípticos de A, D y Clado I20. Una reacción total de 25 µl que consta de 2,5 µl de tampón 10 ×, 0,2 mM de cada dNTP, 1 µl de plantilla de ADN (100 ng), 1,5 U de polimerasa Taq (New England Biolabs, Reino Unido), cebadores 0,2 µM excepto el control interno (trpBA). = 0,12 µM) y se utilizó agua Milli Q. Seguimos las mismas condiciones de PCR descritas por Clermont et al. 201320. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %.

La asociación de genes y filogrupos de FV se comparó entre aislados de ESBL y no ESBL-ExPEC mediante la prueba U de Mann-Whitney. La distribución de genes VF entre filogrupos se probó mediante las pruebas de Friedman y Kruskal-Wallis. El valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Investigación del Instituto Nacional del Cáncer (número de certificado 020/2562).

Los conjuntos de datos generados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio NCBI de genbank, con el número de acceso que incluye OP999005-OP999011. Estos conjuntos de datos se derivaron de los siguientes recursos de dominio público: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999005, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999006, https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999007, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999008, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999009 , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999010, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999011.

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Descargar referencias

Agradecemos al Fondo Second Century (C2F), Beca Postdoctoral, Universidad Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Tailandia.

Este proyecto de investigación fue apoyado parcialmente por la Unidad de Investigación de Diagnóstico Innovador de Resistencia a los Antimicrobianos, el fondo Ratchadapisek Sompoch Endowment y el Fondo Second Century (C2F) de la Universidad de Chulalongkorn. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Unidad de Investigación de Diagnóstico Innovador de Resistencia a los Antimicrobianos, Departamento de Medicina Transfusional y Microbiología Clínica, Facultad de Ciencias de la Salud Afines, Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia

Naeem Ullah y Nuntaree Chaichanawongsaroj

Programa de Ciencias Moleculares en Microbiología e Inmunología Médicas, Departamento de Medicina Transfusional y Microbiología Clínica, Facultad de Ciencias de la Salud Afines, Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia

Thadchaporn Assawakongkarat

Departamento de Bacteriología I, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (NIID), Tokio, Japón

Yukihiro Akeda

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Este estudio fue concebido y diseñado por NC. El trabajo experimental y el análisis de datos fueron realizados por NU y TA, y el borrador del manuscrito fue realizado por N. Algunos reactivos fueron apoyados por YA. La adquisición de fondos, el análisis estadístico, la edición y la finalización del manuscrito fueron realizados por NC Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Nuntaree Chaichanawongsaroj.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ullah, N., Assawakongkarat, T., Akeda, Y. et al. Detección de aislados de Escherichia coli productores de β-lactamasas de espectro extendido mediante amplificación isotérmica y asociación de sus genes de virulencia y filogrupos con infección extraintestinal. Informe científico 13, 12022 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39228-w

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Recibido: 03 de noviembre de 2022

Aceptado: 21 de julio de 2023

Publicado: 25 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39228-w

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