Un enfoque de microfluidos para la etiqueta. | Grupo separador de gravedad Co., Ltd

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11011 (2023) Citar este artículo

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Los microplásticos marinos están surgiendo como una creciente preocupación ambiental debido a su daño potencial a la biota marina. Las variaciones sustanciales en sus propiedades físicas y químicas plantean un desafío importante cuando se trata de muestrear y caracterizar microplásticos de pequeño tamaño. En este estudio, presentamos un nuevo enfoque de microfluidos que simplifica el proceso de captura e identificación de microplásticos en el agua de mar superficial, eliminando la necesidad de etiquetado. Examinamos varios modelos, incluida la máquina de vectores de soporte, el bosque aleatorio, la red neuronal convolucional (CNN) y la red neuronal residual (ResNet34), para evaluar su desempeño en la identificación de 11 plásticos comunes. Nuestros hallazgos revelan que el método CNN supera a los otros modelos, logrando una impresionante precisión del 93% y un área media bajo la curva de 98 ± 0,02%. Además, demostramos que los dispositivos miniaturizados pueden atrapar e identificar eficazmente microplásticos de menos de 50 µm. En general, este enfoque propuesto facilita el muestreo y la identificación eficientes de microplásticos de pequeño tamaño, lo que podría contribuir a esfuerzos cruciales de seguimiento y tratamiento a largo plazo.

La contaminación por microplásticos se ha convertido en una preocupación mundial y se estima que hay aproximadamente 24,4 billones de piezas de microplásticos en la parte superior del océano, lo que enfatiza la amplia presencia de este contaminante en los ambientes marinos1. Con el tiempo, el impacto acumulativo de la contaminación por microplásticos en la biota marina ha generado importantes amenazas para la salud, lo que supone un grave riesgo para todo el ecosistema2. El muestreo eficiente, la identificación precisa y la caracterización química confiable de los microplásticos son cruciales para comprender sus impactos ambientales y biológicos. Sin embargo, persiste la falta de procesos sistemáticos debido a la naturaleza intrincada de los microplásticos ambientales, que abarca factores como sus diferentes tamaños, formas, etapas de degradación, agregación y la presencia de biopelículas asociadas. Actualmente, hay tres áreas principales de enfoque cuando se trata de estudiar microplásticos marinos: muestreo, tratamientos de muestras con control de contaminación e identificación de microplásticos3. El muestreo ideal permite una recolección de microplásticos de alta fidelidad que retiene toda la información necesaria adquirida de forma natural sin contaminación cruzada no deseada. Sin embargo, los métodos convencionales de muestreo y separación, como la separación por densidad, la separación visual y la flotación pasiva, tienen una capacidad limitada para separar eficazmente partículas pequeñas a escala submicrónica4, que de hecho representan la mayoría de los microplásticos en los mares. Otros métodos, como la digestión ácida y la digestión enzimática, son procesos costosos y pueden implicar el uso de productos químicos altamente tóxicos que podrían dañar la integridad de las muestras5. Otro área de preocupación es la posibilidad de contaminación cruzada entre los dispositivos de muestreo y las partículas atmosféricas, lo que puede presentar desafíos adicionales para evaluar y cuantificar con precisión la contaminación por microplásticos6. Aunque las estrategias de mitigación, como la medición de muestras en blanco, pueden ayudar a minimizar los errores experimentales, estos métodos sólo eliminan las contaminaciones en el laboratorio central7. Como se enfatiza en una revisión de Hidalgo-Ruz et al.8, quienes resumieron las metodologías tradicionales en 68 estudios de microplásticos marinos, desarrollar metodologías efectivas que distingan fracciones de mayor tamaño, prevengan la contaminación y permitan una identificación y caracterización efectivas siguen siendo una tarea crítica en el campo.

Se ha demostrado que la tecnología microfluídica es una herramienta poderosa para la clasificación y separación de partículas hoy en día gracias a sus ventajas como ahorro de costos, respuesta rápida, alto rendimiento y adaptabilidad en muchas aplicaciones9,10. Estudios recientes revelaron que sus capacidades se han extendido a la investigación de microplásticos11,12,13,14,15. Por ejemplo, Elsayed et al.16 informaron sobre una plataforma de análisis de microoptofluídicos para clasificar partículas de microplásticos en agua del grifo. Los microplásticos clasificados (1–100 µm) quedaron atrapados en microfiltros para la caracterización química por espectroscopía infrarroja por transformada Raman y de Fourier (FTIR). Sin embargo, la acumulación indeseable de partículas dio lugar a picos Raman mixtos que aumentaron innecesariamente las dificultades de caracterización de las muestras.

Por último, la identificación precisa es otro paso esencial en la caracterización de microplásticos marinos. Actualmente, las dos técnicas de identificación química más comunes son la espectroscopia Raman y FTIR. Este último es un método fiable para analizar microplásticos, pero los requisitos de muestras secas y relativamente grandes (> 10 µm) han limitado sus aplicaciones17,18. Por otro lado, la espectroscopia Raman presenta varias ventajas, incluida una mayor resolución y una fácil preparación de muestras, lo que permite la identificación de partículas con tamaños cercanos a 1 µm. Más importante aún, este método también es aplicable a muestras líquidas, incluso a microescala19,20.

Hacer coincidir los espectros (tanto Raman como FTIR) con los espectros de referencia ahora se considera ampliamente como el método estándar de oro para la identificación de microplásticos. Sin embargo, la precisión y eficiencia de este método se ven obstaculizadas por varios factores. La precisión del esquema matemático de coincidencia del espectro está significativamente influenciada por la calidad de la señal21 y, desafortunadamente, esta calidad puede verse comprometida por los efectos de fluorescencia y luminiscencia. La ausencia de una base de datos de referencia integral adaptada a diferentes muestras ambientales plantea un desafío para la identificación de muestras22, y el proceso en sí suele ser laborioso y depende de juicios de expertos.

Gracias a los rápidos avances de las tecnologías de aprendizaje automático, los modelos pueden mejorar su rendimiento basándose en conjuntos de datos personalizados y emitir juicios apropiados sin asistencia humana cuando se descubren nuevas muestras. Estas tecnologías no solo permiten una poderosa extracción y clasificación de características, sino que también exhiben alta precisión, flexibilidad y adaptabilidad23. Hasta donde saben los autores, solo se ha informado de un estudio sobre la identificación de microplásticos basada en Raman utilizando tecnologías de aprendizaje automático24; sin embargo, todavía se demandan enfoques de identificación más precisos aplicables a más tipos de plástico con tamaños hasta microescala.

En este estudio, proponemos un enfoque novedoso para agilizar el proceso de muestreo e identificación de microplásticos marinos. Nuestro método integra los beneficios de los microfluidos, la espectroscopia Raman y las tecnologías de aprendizaje automático, con el objetivo de mejorar la eficiencia y precisión del análisis de microplásticos en ambientes marinos (Fig. 1). Específicamente, construimos un conjunto de datos de capacitación integral combinando muestras recolectadas en el laboratorio con conjuntos de datos disponibles públicamente. Nuestro estudio implicó una investigación sistemática para evaluar y comparar el rendimiento de identificación de cuatro modelos de aprendizaje automático: el modelo de máquina de vectores de soporte (SVM), el modelo de bosque aleatorio (RF), las redes neuronales convolucionales (CNN) y las arquitecturas ResNet34. Nuestros hallazgos revelan que el modelo CNN supera a los otros modelos, con una precisión de clasificación promedio del 93%. Para demostrar la eficacia de los dispositivos de microfluidos para atrapar e identificar microplásticos, presentamos un dispositivo de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) que presenta estructuras similares a tamices diseñadas específicamente para capturar partículas de pequeño tamaño. En un experimento de prueba de concepto, se identificaron con precisión todas las partículas prístinas atrapadas. Además, validamos con éxito la viabilidad del muestreo y la identificación de campo utilizando muestras recolectadas de una playa local (Narragansett, RI, EE. UU.).

Esquema del proceso simplificado de identificación de microplásticos marinos. (a) Se utiliza un dispositivo de microfluidos ensamblado para la recolección in situ de muestras de agua de mar, que se somete a una filtración inicial utilizando un filtro de 45 µm, (b) Después de transportar de manera segura el dispositivo de regreso al laboratorio, se aplica una solución del 30 % (v/ v) se inyecta peróxido de hidrógeno en el dispositivo, donde se deja durante 16 h para facilitar el procesamiento de la muestra. Posteriormente, se adquieren espectros Raman de las muestras procesadas; (c) Proceso de identificación de aprendizaje automático incorporado en el método basado en microfluidos para el análisis de microplásticos marinos.

Primero entrenamos los modelos con el conjunto de datos de entrenamiento original y evaluamos el rendimiento de la clasificación en el conjunto de datos de prueba. Las matrices de confusión se muestran en la Fig. 2a y las métricas de evaluación de precisión, F1 y puntuaciones de MCC se resumen en la Tabla 1. El modelo SVM logró la mejor precisión de clasificación promedio del 82,0%, superando a los modelos CNN y ResNet34. que sólo alcanzó el 77% de precisión. Estos hallazgos contradicen estudios previos que sugerían una precisión superior para los modelos CNN y ResNet, lo que indicaba que el conjunto de datos de entrenamiento original era insuficiente para entrenar eficazmente modelos de aprendizaje profundo25,26. Para abordar este problema, volvimos a entrenar los modelos utilizando un conjunto de datos aumentado y reevaluamos su rendimiento de clasificación en el conjunto de datos de prueba. La Figura 2b ilustra las matrices de confusión derivadas del conjunto de datos de entrenamiento aumentado, mientras que la Tabla 2 presenta una comparación de las métricas de evaluación. Notablemente, todos los modelos exhibieron mejoras significativas en los resultados de precisión. La Figura 2c muestra las mejoras en la precisión de la clasificación para cada clase al comparar el conjunto de datos de entrenamiento original con el conjunto de datos de entrenamiento aumentado. Específicamente, la precisión de los modelos SVM, RF, CNN y ResNet34 aumentó en un 4,8%, 23,7%, 16,5% y 15,4%, respectivamente. El rendimiento comparable de CNN y ResNet34 en ambos conjuntos de datos de entrenamiento se puede atribuir a las capas de extracción de características convolucionales compartidas en estas dos arquitecturas. Sin embargo, la sensibilidad de diferentes modelos a diferentes tamaños de datos resalta la necesidad de un análisis más detallado de la relación entre los modelos y los conjuntos de datos de entrenamiento27. Simplemente aumentar la cantidad de puntos de datos de entrenamiento es insuficiente para comparar efectivamente las ventajas de estos dos modelos. Sin embargo, cuando se incorporan tipos de materiales adicionales y muestras ambientales con condiciones de degradación complejas, la disparidad de rendimiento entre estos dos modelos se vuelve más discernible. Con la implementación del aumento de datos, tanto el modelo CNN como el ResNet34 demostraron una alta precisión, superando el 93%. En comparación, el modelo SVM logró una precisión del 86,8%. Estos hallazgos resaltan el rendimiento superior de los modelos CNN y ResNet34, lo que corrobora aún más estudios previos que han informado de su eficacia en el manejo de conjuntos de datos más grandes28. Sin embargo, cabe mencionar que la baja precisión obtenida por el modelo RF contradice los resultados de Ramanna et al. 202229. En vista de esto, el modelo de RF no se utilizará en este estudio. Dado el desempeño comparable de CNN y ResNet34, hemos optado por continuar con CNN para realizar más demostraciones en este documento.

Matrices de confusión que representan la precisión de la clasificación de cuatro modelos de aprendizaje automático en el conjunto de datos de prueba. (a) Los modelos se entrenaron con el conjunto de datos de entrenamiento original; (b) Los modelos se entrenaron con el conjunto de datos de entrenamiento aumentado. (c) Comparaciones de la precisión de la identificación en el conjunto de datos de prueba para cada tipo de plástico según los conjuntos de datos de entrenamiento originales y aumentados.

Para dilucidar la precisión de la clasificación para todos los tipos de plástico, las mejoras de cada tipo de material se comparan una al lado de la otra (Fig. 2c). La precisión de la clasificación de materiales como nailon, cloruro de polivinilo (PVC) y acetato de celulosa (CA) sigue siendo alta para todos los modelos entrenados con ambos conjuntos de datos de entrenamiento. La identificación de los tres tipos de plástico más abundantes, poliestireno (PS), polipropileno (PP) y polietileno (PE), mejoró después del aumento de datos, siendo el PE el que mejoró de manera más significativa. Además, la clasificación entre tereftalato de polietileno (PET) y poliéster mejoró sustancialmente después del entrenamiento con el conjunto de datos aumentado, dado que ambos materiales tienen composiciones químicas similares. Este resultado resalta el potencial para una identificación precisa mediante la introducción de materiales adicionales con compuestos químicos similares pero estructuras físicas ligeramente diferentes, como polietileno de alta densidad (HDPE), polietileno de baja densidad (LDPE), nailon 6, nailon 6, 6 y muchos más. otros. Cuando se trata de muestras ambientales, es inevitable encontrar variaciones en los espectros debido a las complejas condiciones climáticas y la presencia de diversos aditivos en los productos. Estos factores contribuyen a las disparidades en los datos espectrales, lo que hace que la identificación precisa sea más desafiante. Vale la pena señalar que en el caso de microplásticos severamente degradados, ciertos enlaces de huellas dactilares Raman pueden perderse debido a una fotooxidación extensa, cambios fisicoquímicos y degradación microbiana31. En tales escenarios, confiar únicamente en el análisis de espectroscopía Raman para una identificación precisa puede no ser suficiente. Las mejoras de los modelos de aprendizaje automático mediante la integración de conjuntos de datos más completos de microscopía electrónica de barrido y espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (SEM-EDS) pueden considerarse como un enfoque adicional para la identificación de la composición de elementos y el análisis de la morfología de la superficie.

Además, generamos la curva característica operativa del receptor (ROC) trazando la sensibilidad frente a la tasa de falsos positivos y calculamos las puntuaciones promedio del área bajo la curva ROC (AUC) para los modelos SVM y CNN utilizando el método uno versus resto (OvR) para evaluar la sensibilidad y especificidad de estos dos modelos en varios umbrales32. Como se muestra en la Fig. 3, CNN supera a SVM, como lo demuestra una puntuación AUC promedio más alta de 98 ± 0,02%. En este escenario de clasificación, nuestro objetivo es minimizar las clasificaciones erróneas logrando la tasa de falsos positivos (FPR) más baja y la tasa de verdaderos positivos (TPR) más alta para que podamos maximizar la probabilidad de detectar clases positivas. La tasa de falsos positivos (FPR) representa la proporción de instancias o muestras negativas que se clasifican incorrectamente como positivas. Cuantifica la velocidad a la que el modelo clasifica erróneamente partículas que no son microplásticos como uno de los polímeros entrenados. En el umbral óptimo calculado, el FPR para los modelos SVM y CNN es 0,08 y 0,048 y el TPR es 0,900 y 0,930 respectivamente. En consecuencia, el modelo CNN demuestra un rendimiento de clasificación ligeramente mejorado en comparación con el modelo SVM.

Curvas ROC y evaluación AUC promedio de los modelos SVM y CNN para todas las clases según el método OvR. (a) modelo SVM entrenado con el conjunto de datos de entrenamiento aumentado; (b) Modelo CNN entrenado con el conjunto de datos de entrenamiento aumentado. Las clases corresponden a diferentes tipos de plástico: 0-PS, 1-PP, 2-PET, 3-Poliéster, 4-Nylon, 5-PC, 6-PE, 7-PUR, 8-PVC, 9-PMMA y 10 -CALIFORNIA. Los puntos de umbral óptimos se calculan basándose en curvas ROC micropromedias indicadas con la estrella roja.

Además del rendimiento evaluado en el conjunto de datos de prueba, también se utilizaron modelos SVM y CNN para identificar partículas de pequeño tamaño atrapadas en un dispositivo de microfluidos. Aunque los modelos se entrenaron utilizando plásticos relativamente más grandes en condiciones estáticas junto con bases de datos en línea, los resultados arrojados sugirieron claramente que se puede lograr una identificación precisa de los microplásticos prístinos atrapados, con una precisión cercana al 100%. Específicamente, se mezclaron partículas de PE fluorescentes (20-27 µm) con partículas regulares de PE (10–45 µm) y PS (9,5–11,5 µm), proporcionando las bases para la identificación basada en la fluorescencia y el tamaño. Los resultados mostraron que todas las partículas de PE fluorescente quedaron atrapadas en la zona B, donde el tamaño de captura fue diseñado para ser de 11 a 20 µm (Fig. 4a). Luego, los espectros Raman de estas partículas se recopilaron, procesaron e importaron a los modelos SVM y CNN entrenados para su predicción. Los resultados mostraron que ambos modelos identificaron correctamente todos los microplásticos prístinos, de los cuales las partículas 1 a 6 fueron identificadas al 100% por ambos modelos. El modelo SVM arrojó una precisión del 100 % para la partícula 7, mientras que el modelo CNN predijo que la partícula era 99,12 % PE, 0,87 % PS y 0,01 % nailon. Si bien existe una probabilidad del 0,88 % de que la muestra fuera predicha como de otros tipos, es poco probable que esta pequeña discrepancia plantee un problema importante para las aplicaciones habituales que involucran microplásticos marinos.

Atrapando partículas de PE fluorescentes y partículas de PE y PS normales en un dispositivo de microfluidos. (a) Las 7 partículas de PE fluorescentes seleccionadas quedan atrapadas en la zona B; (b) Distribución de las 19 partículas seleccionadas al azar, incluidas 16 partículas de PE y 3 partículas de PS. Los resultados previstos se muestran entre paréntesis.

Para validar aún más la tarea de identificación, examinamos 19 micropartículas seleccionadas al azar de diferentes rangos de tamaño a lo largo del canal, como se ilustra en la Fig. 4b. Tenga en cuenta que, aunque las partículas de PS no eran fluorescentes, aún podían distinguirse de las partículas de PE bajo el microscopio debido a la notable diferencia de tamaño. Los resultados mostraron que la mayoría de las partículas de PS fueron capturadas en la zona C (tamaño de captura de 10-6 µm) y solo la partícula 1 (PS-1, 10 µm) fue capturada en la Zona A junto a una partícula de PE grande. Las 19 partículas fueron identificadas al 100% como el microplástico correcto. En conjunto, nuestro modelo mostró un rendimiento prometedor en la identificación de microplásticos prístinos de pequeño tamaño. Sin embargo, es importante reconocer la necesidad de realizar más validaciones y pruebas en diversos entornos experimentales para establecer su solidez y generalización.

Por último, el enfoque propuesto para la captura e identificación de microplásticos se evaluó más a fondo utilizando muestras ambientales. Se recogió un cubo de muestra de agua de mar de una playa local y posteriormente las partículas quedaron atrapadas en el dispositivo y transportadas de regreso al laboratorio para la adquisición de espectros Raman. Las micropartículas atrapadas recolectadas del muestreo in situ se muestran en la Fig. 5a. Dado que las partículas con materia orgánica asociada y biopelículas recubiertas no fueron el enfoque principal de este artículo y se abordarán en estudios futuros, se aplicó un método de procesamiento de muestras basado en peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30% (v/v) de estudios anteriores33. La Figura 5b muestra las micropartículas atrapadas después del proceso. Los hallazgos sugieren que la obstrucción inicial causada por la suciedad en las zonas B y C se eliminó con éxito mediante oxidación con peróxido. La Figura 5c presenta las partículas que se identificarán bajo el microscopio Raman. Utilizamos modelos CNN y SVM para identificar las micropartículas atrapadas según los espectros Raman sin procesar (Fig. S2). Los resultados de la identificación se validaron con KnowItAll (John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, Nueva Jersey), un software de identificación de espectros Raman ampliamente utilizado que emplea el método de coincidencia de espectros de referencia, y Open Specy, una comunidad en línea y una herramienta accesible para la identificación de espectros Raman e IR. . La Tabla 3 muestra los resultados de identificación, junto con los tres principales resultados de predicción obtenidos de KnowItAll y Open Specy34.

Imágenes que ilustran las partículas atrapadas en el agua del mar. (a) Las micropartículas atrapadas se recogieron del agua de la superficie del mar; (b) Las micropartículas atrapadas después de que las muestras fueron tratadas con H2O2 al 30% (v/v); (c) las partículas se observan bajo un microscopio Raman utilizando objetivos de 50 × y 100 ×. Las partículas 1, 2 y 4 están en forma de perlas. Las partículas 3 y 5 están en forma de fibra.

En general, los resultados de predicción de nuestros modelos de aprendizaje automático para partículas se compararon con dos populares programas de identificación de espectro Raman, KnowItAll y Open Specy34. Las partículas 1 y 4 se identificaron consistentemente como polietileno mediante los tres métodos. Para validar el resultado de la identificación de la partícula 2, se analizaron visualmente los espectros Raman sin procesar, específicamente haciendo coincidir los picos de huellas dactilares para PE35. La clasificación errónea de KnowItAll podría deberse a la baja relación señal-ruido (SNR) en comparación con las otras partículas. Además, aunque Open Specy tiene una biblioteca de espectro más grande, sufre algunos picos superpuestos que coinciden con otros materiales en lugar de polímeros. Cabe mencionar que debido a los diferentes resultados de identificación obtenidos de los tres recursos, se recomienda realizar una validación cruzada utilizando herramientas de identificación de espectro Raman adicionales en el futuro. Este proceso de validación podría mejorarse aún más combinándolo con otras herramientas de análisis como FTIR y análisis de imágenes. Los resultados de identificación de las partículas 3 y 5 son similares entre el método de aprendizaje automático y KnowItAll, pero difieren de los resultados obtenidos con Open Specy. Esta discrepancia se puede atribuir a la biblioteca de espectro más grande y a la menor calidad de los datos de Open Specy. En consecuencia, existe la posibilidad de que las partículas 3 y 5 no sean polímeros y el algoritmo de aprendizaje automático podría haber proporcionado predicciones falsas positivas.

Cuando se trata de la identificación Raman de microplásticos ambientales submicrónicos, el método tradicional de coincidencia de picos a menudo se beneficia de un espectro Raman más limpio, que se puede lograr mediante el uso de un láser Raman de alta potencia. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el empleo de una alta potencia de láser Raman conlleva el riesgo de quemar las partículas. Además, estos métodos convencionales a menudo implican pasos de procesamiento adicionales que pueden dañar los plásticos, comprometiendo la integridad de los espectros Raman. Con las ventajas que ofrecen las tecnologías de aprendizaje automático, las variaciones complejas en los espectros que se originan en diversas condiciones ambientales pueden interpretarse correctamente; el enfoque futuro debe centrarse en cómo los diferentes aditivos, la degradación por intemperismo y la bioincrustación pueden afectar los espectros y si los modelos de aprendizaje automático pueden ayudar. Desentrañemos las misteriosas huellas dactilares subyacentes.

Para mejorar la capacidad de separación y captura del dispositivo, se podría utilizar una combinación con un separador de alto rendimiento y otras técnicas activas de captura de partículas, como un hidrociclón36. Además, también se debe considerar el reciclaje de partículas del sistema de microfluidos para mejorar aún más el sistema para otros estudios posteriores. Una posible solución es agregar microelectrodos que generen dielectroforesis negativa para liberar selectivamente las partículas objetivo37. En general, el dispositivo es beneficioso para la detección precisa de microplásticos, principalmente debido a su capacidad para atrapar una cantidad extremadamente pequeña de partículas en una sola trampa. Esta característica simplifica la tarea de centrarse en partículas individuales durante el análisis Raman, lo que puede resultar complicado cuando se utilizan métodos convencionales como papeles de filtro donde las partículas pueden incrustarse en capas de fibra más profundas38. Otra ventaja principal de utilizar el dispositivo de microfluidos sobre los métodos de muestreo convencionales es la reducción efectiva de la contaminación cruzada de partículas atmosféricas, ya que los microplásticos permanecen atrapados dentro del canal durante todo el proceso sin exposición a la atmósfera circundante.

En resumen, este artículo presenta un dispositivo de microfluidos prometedor diseñado específicamente para la captura e identificación eficiente de microplásticos. El método de captura propuesto tiene un gran potencial para minimizar la contaminación cruzada y disminuir la dependencia del trabajo manual. Demuestra una captura eficiente de partículas microplásticas prístinas, incluso en pequeñas cantidades, al tiempo que ofrece capacidades selectivas de tamaño. Las pruebas experimentales han demostrado con éxito la capacidad del dispositivo para atrapar eficazmente partículas microplásticas ambientales en agua de mar real. Estos resultados positivos proporcionan evidencia alentadora de la practicidad y efectividad del dispositivo en condiciones del mundo real. Sin embargo, es importante reconocer que todavía existen preocupaciones que deben abordarse para mejorar aún más su desempeño. Por ejemplo, una forma de mejorar la escalabilidad de este sistema es implementando paralelización y conectando múltiples dispositivos en serie. Este enfoque puede aumentar el rendimiento general y la eficiencia del proceso de captura. Además, si bien el método actual de captura de partículas se basa en la fuerza hidrodinámica a un caudal bajo, la integración de otros métodos activos con el chip tiene el potencial de aumentar aún más el rendimiento. Además, la integración de la espectroscopia Raman portátil con sistemas avanzados de identificación de aprendizaje automático tiene un gran potencial para el seguimiento continuo in situ de los microplásticos39.

Para facilitar la adopción de este sistema para el monitoreo ambiental a largo plazo, la rentabilidad se convierte en una consideración crucial. Un enfoque viable para mitigar el costo de fabricar dispositivos de microfluidos es utilizar directamente tecnología de impresión 3D para crear los propios dispositivos. Este enfoque elimina la necesidad de moldes y agiliza el proceso de fabricación, reduciendo así los costes40. Sin embargo, es importante prestar atención a los materiales utilizados para la impresión 3D de los dispositivos de microfluidos. Dado el enfoque en el análisis de microplásticos, es esencial considerar los riesgos potenciales de introducir partículas de plástico adicionales durante el proceso de fabricación. Es necesaria una selección cuidadosa de materiales de impresión 3D apropiados que minimicen la liberación de microplásticos para garantizar la integridad del análisis y evitar la introducción de contaminantes no deseados.

Además, debido a las variaciones en forma, tamaño y características únicas de las partículas ambientales, es crucial considerar estos factores para un rendimiento óptimo. Sin embargo, capturar e identificar nanoplásticos ambientales presenta desafíos importantes. La integración de este sistema con otros métodos activos puede proporcionar un enfoque más eficaz, especialmente para los nanoplásticos. Al combinar las capacidades de este dispositivo de microfluidos con métodos activos diseñados para el análisis de nanoplásticos, en futuros estudios se podría lograr una caracterización integral de los nanoplásticos en muestras ambientales41,42,43.

Además, es esencial ampliar la biblioteca de datos del espectro Raman para incluir una gama más amplia de polímeros erosionados e incorporar espectros Raman de otros materiales en el conjunto de datos de entrenamiento. Esta expansión mejorará la capacidad de los modelos de aprendizaje automático para identificar varios tipos de partículas ambientales y reducir la tasa de falsos positivos44. También brinda la oportunidad de evaluar las fortalezas y debilidades de diferentes algoritmos de aprendizaje automático, lo que permite un análisis integral y la selección de los modelos más adecuados para predicciones precisas y confiables. Además, mediante la utilización de técnicas de segmentación de datos y la realización de análisis de imágenes en profundidad, podemos esperar obtener una comprensión más profunda de conocimientos valiosos sobre las partículas y sus contextos ambientales interconectados45,46. En general, el conocimiento contribuiría a una comprensión más completa de las fuentes, el destino y el transporte de partículas ambientales, lo que permitiría implementar intervenciones específicas y estrategias de mitigación.

Se estudiaron un total de 11 tipos de plásticos que representan microcontaminantes marinos comúnmente recolectados, incluidos poliestireno (PS), polipropileno (PP), polietileno (PE), poliamida (PA, nailon), poliéster, tereftalato de polietileno (PET), cloruro de polivinilo ( PVC), poliuretano (PUR), policarbonato (PC), poli(metacrilato de metilo) (PMMA) y acetato de celulosa (CA). Las muestras de PC y PUR se prepararon a partir de láminas y tubos transparentes, respectivamente. El resto de las muestras se prepararon utilizando los polímeros del Polymer Kit 1.0 (Centro de Investigación de Desechos Marinos de la Universidad del Pacífico de Hawai). Se presentaban en diversas formas, incluidos gránulos, fibras, perlas y polvo. Las partículas utilizadas en los experimentos de captura de microfluidos son microesferas de PE (20–27 µm y 10–45 µm) y PS (9,5–11,5 µm) de Cospheric LLC. (Goleta, California, Estados Unidos). Para construir el conjunto de datos de prueba de aprendizaje automático, también se aplicaron más muestras de productos plásticos cotidianos comunes (Tabla S1).

En este estudio se utilizó un microscopio Raman confocal (CRM) WITec alpha 300 R. Está equipado con dos longitudes de onda de láser de excitación, 532 y 785 nm. Las rejillas de difracción utilizadas fueron 1200 g/mm y 300 g/mm para 532 nm y 785 nm, respectivamente. Se utilizaron diferentes potencias de aumento y objetivos (10X, 50X y 100X) según los tamaños de muestra para obtener los espectros Raman más comprensibles. Todos los espectros se recogieron con un tiempo de acumulación de 1 s y 100 iteraciones. Se recolectó un rango completo de cambios de longitud de onda (10–4000 cm-1) para todas las muestras y luego se truncó a 300-2000 cm-1 que representa la región de las huellas dactilares, que generalmente es suficiente para la identificación del material47.

Las prístinas muestras de plástico del kit de polímeros se analizaron en un portaobjetos de vidrio para microscopio normal; la mayoría de las muestras son gránulos de 3 a 5 mm. La muestra de CA se presenta en forma de polvo, el tamaño medio de partícula (dimensión más larga) es de aproximadamente 0,387 mm. La muestra de poliéster es una tela blanca y se cortó en cuadrados de 5 por 5 mm para realizar pruebas. Se prepararon 10 muestras para cada tipo de plástico, entre las cuales cinco muestras se probaron con una longitud de onda de excitación de 532 nm, mientras que las otras cinco muestras se probaron con una longitud de onda de 785 nm. Todos los datos se recolectaron con un objetivo de 10X y se recolectaron tres espectros Raman para cada muestra con diferentes potencias de láser, 5 mW, 10 mW y 15 mW. Por lo tanto, se recogieron un total de 10 × 3 (5, 10, 15 mW) = 30 espectros sin procesar para cada tipo de plástico prístino. Los productos de plástico diarios se recolectaron y probaron una vez para cada muestra con el aumento y la potencia del láser más adecuados. Tenga en cuenta que las muestras transparentes, como las hojas transparentes de PC, se probaron utilizando una longitud de onda de 532 nm gracias a su fondo de fluorescencia insignificante, mientras que las muestras teñidas de color, como los hilos de poliéster negros, se probaron con una longitud de onda de 785 nm porque una longitud de onda de excitación más alta puede disminuir el fondo de fluorescencia y proporcionar una mejor relación señal-ruido48. En resumen, se recopiló un total de 330 puntos de datos de materiales prístinos y 59 puntos de datos de productos diarios.

Se inyectaron muestras mixtas de microesferas de PE y PS en el microcanal y se atraparon mediante estructuras similares a tamices para probar el concepto de captura e identificación de microplásticos in situ en dispositivos de microfluidos. Tenga en cuenta que, aunque el canal de microfluidos estaba hecho de PDMS mediante litografía suave estándar, se colocó un portaobjetos de vidrio encima del canal para formar un canal cerrado sin unión permanente. Como tal, la cubierta se puede quitar si es necesario para eliminar posibles señales de fondo en partículas más pequeñas. Las partículas atrapadas se probaron utilizando objetivos de 50 × y 100 × con una longitud de onda de excitación de 785 nm y varias intensidades de láser dependiendo de sus tamaños para recolectar espectros Raman.

Para desarrollar un conjunto de datos de capacitación integral, se adoptaron dos repositorios de datos Raman de microplásticos de código abierto, bibliotecas espectrales de plásticos regulares (SLOPP) y una base de datos de meteorización ambiental (SLOPPE)49, y una base de datos Mendeley que contiene espectros recopilados de muestras estándar y de meteorización natural50. para complementar los datos brutos recopilados de muestras prístinas descritas anteriormente. Teniendo en cuenta la cantidad y calidad de los datos, tomamos la decisión de incorporar todos los datos de la biblioteca SLOPP y una parte de la biblioteca Mendeley al conjunto de datos de entrenamiento. Esta elección se tomó porque algunos espectros en el conjunto de datos de Mendeley se originaron a partir de muestras severamente erosionadas, lo que les impidió proporcionar información precisa sobre el terreno. Además, agregamos los datos de la biblioteca SLOPPE y 10 puntos de datos extra prístinos por tipo de plástico al conjunto de datos de prueba. Finalmente, el conjunto de datos de entrenamiento original contiene 587 puntos de datos (Tabla S2) y el conjunto de datos de prueba contiene 265 puntos de datos (Tabla S3).

Para un mayor procesamiento de datos, modificamos los espectros Raman en el entrenamiento y prueba de conjuntos de datos de todas las fuentes al rango de número de onda de huellas dactilares Raman deseado de 300-2000 cm-1 y ajustamos los datos para que tengan la misma dimensión de entrada utilizando WebPlotDigitizer51. Además, se implementaron varias técnicas de aumento de datos para ampliar los conjuntos de datos de entrenamiento. Primero, se agregó ruido blanco gaussiano aditivo (AGWN) a todos los puntos de datos originales, imitando los ruidos espectrales genéricos (p. ej., ruido de disparo, ruido oscuro y ruido de lectura) generados naturalmente52,53. Se aplicaron cinco SNR en el proceso de aumento de datos conservando las formas generales y los picos de los espectros. Por último, los datos aumentados se fusionaron con los conjuntos de datos de espectros originales. Posteriormente, se aplicó la técnica de eliminación de la línea de base polinómica a todos los datos aumentados procedentes de las bibliotecas SLOPP y Mendeley. Este paso fue crucial para mitigar la influencia de las señales de fondo ruidosas presentes en estos espectros. Específicamente, utilizamos la función Características polinómicas de la biblioteca de preprocesamiento de scikit-learn54 y elegimos tres valores de exponente apropiados (grados) para cada punto de datos. En este caso, la cantidad de puntos de datos de las bibliotecas SLOPP y Mendeley se triplicó con respecto al paso de aumento anterior. Sumando todo, se obtuvo un total de 11,772 puntos de datos de entrenamiento (Tabla S4). Vale la pena señalar que el conjunto de datos de prueba no fue sometido a aumento. Finalmente, estandarizamos todos los puntos de datos, específicamente la intensidad Raman, en un rango entre 0 y 1. En la Fig. S2 se puede observar una representación visual de los pasos de procesamiento de datos para una muestra de PP erosionada.

En estudios previos se han explorado ampliamente las tareas de clasificación o identificación basadas en espectroscopia Raman y aprendizaje automático. Estas investigaciones han demostrado la viabilidad de este enfoque y han reportado resultados prometedores55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70. CNN y ResNet se han convertido en opciones populares para este tipo de aplicaciones, mostrando constantemente una precisión de identificación superior en comparación con otros modelos. La aplicación de identificación de microplásticos informada por Ramanna et al. 202271 aprovechó un modelo de RF y entrenó el modelo utilizando la base de datos SLOPP, seguido de las pruebas en la base de datos SLOPPE y logró una precisión del 93,81 %. En este artículo, implementamos cuatro modelos de aprendizaje automático (es decir, modelos SVM, RF, CNN y ResNet34) y comparamos exhaustivamente su desempeño en la identificación de microplásticos de diversas fuentes. Usamos las bibliotecas SVM y RF de scikit-learn. Construimos un modelo CNN utilizando la función Conv1D de la biblioteca Keras (Fig. 6). El modelo CNN comienza con una capa de entrada 1D inicial que contiene un total de 850 puntos de datos. Las capas internas de los modelos comprenden dos capas convolucionales, cada una seguida de una capa de agrupación máxima y una capa de abandono con una tasa de abandono inicial de 0,3, y una capa completamente conectada aplicada después. Se aplicó una función de activación softmax en la capa de salida para la predicción final. Aquí, aplicamos la arquitectura genérica ResNet34 reportada en la referencia72 para nuestra tarea y remodelamos la entrada a un vector unidimensional. Los hiperparámetros utilizados se determinaron en función de la búsqueda de cuadrícula y los métodos de validación cruzada diez veces (Tabla S5).

Arquitectura CNN utilizada en este artículo. La arquitectura contiene dos capas de convolución. La primera capa de convolución tiene un filtro de tamaño 64. La segunda capa de convolución tiene 32 filtros.

La precisión de la clasificación es una métrica crucial que determina el desempeño de un algoritmo en el desempeño de la identificación de microplásticos. Un método sencillo para visualizar e interpretar esta métrica es trazar la precisión del entrenamiento y la validación, y el historial de pérdida de entropía cruzada. Sin embargo, esta métrica por sí sola es insuficiente para evaluar la solidez de la precisión de la predicción del modelo, especialmente para conjuntos de datos desequilibrados73. Para abordar este problema, se aplicaron varias métricas de evaluación que son bien conocidas para aplicaciones de clasificación multiclase, como la matriz de confusión, la puntuación F1 y la puntuación MCC. En cada pliegue de entrenamiento, los puntos de datos se dividen en un 80% de datos de entrenamiento y un 20% de datos de validación. La precisión de clasificación promedio se obtuvo después de 10 pliegues. Se visualiza una matriz de confusión para evaluar la precisión de la clasificación del modelo en el conjunto de datos de prueba retenido. También adoptamos matrices que incluyen la puntuación F1 promedio macro, la puntuación F1 promedio ponderada y el coeficiente de correlación de Matthews (MCC) para evaluar el rendimiento de clasificación general de todos los modelos.

Trazamos la curva ROC (curva característica operativa del receptor) y comparamos el AUC (área bajo la curva ROC) utilizando el método One vs Rest (OvR) para evaluar la precisión de la predicción para una clase en particular y comprender qué tan bien los modelos distinguen entre clases. El ROC AUC evalúa la capacidad de clasificación de los modelos en varios umbrales. En este caso, queremos que el umbral sea el TPR más alto y el FPR más bajo. Calculamos el umbral óptimo encontrando el punto que maximiza TPR-FPR en la curva ROC micropromedio, que está representada por el índice de Youden, \(J\)74:

La sensibilidad es el eje y de la curva ROC, que se calcula como

El eje x de la curva ROC representa la especificidad 1, que se calcula como

Como se indicó anteriormente, estudios anteriores han pasado por alto durante mucho tiempo los microplásticos a escalas micro y submicrónica, que de hecho son uno de los contaminantes más abundantes y preocupantes en el agua de mar. Aprovechando las ventajas de la capacidad de captura de partículas de los microfluidos, se adoptó un dispositivo de captura hidrodinámico pasivo basado en microestructuras prediseñadas o jaulas de captura, que no requiere campos de conducción externos y es fácil de usar para personas no profesionales.

El dispositivo de microfluidos desarrollado en este artículo es similar a los dispositivos tradicionales de vidrio PDMS fabricados con litografía blanda estándar, aunque no se realizó una unión permanente. Para evitar fugas, se aplicó un dispositivo impreso en 3D como se muestra en la Fig. 7a. Para inyectar las muestras de microplástico en el dispositivo (Fig. 7b), se utilizó una bomba de jeringa (Fusion 200, Chemyx Inc., Stafford, TX, EE. UU.) y los desechos se recogieron en un vaso desechable. Tenga en cuenta que la captura se produjo en tres trampas tipo tamiz de diferentes tamaños (Fig. 7c) que se usarán para atrapar microplásticos con rangos de tamaño correspondientes, 45 a 21 µm (zona A), 20 a 11 µm (zona B). y 10–6 µm (zona C). Todas las demás dimensiones del canal se mantuvieron de acuerdo con las proporciones recomendadas especificadas en la referencia75.

Configuración del dispositivo de microfluidos y configuración del experimento de prueba de concepto. (a) El dispositivo de microfluidos ensamblado en el dispositivo de sujeción; (b) Foto que ilustra la configuración experimental para pruebas in situ. La configuración incluye una bomba de jeringa para suministrar flujo de entrada a un caudal constante y un recipiente colector para recibir los residuos de salida; (c) Las tres zonas de captura de diferentes tamaños de partículas objetivo; (d) Las partículas quedan atrapadas y separadas en pequeñas cantidades en estructuras similares a tamices de tamaños correspondientes.

El experimento de prueba de concepto se realizó inicialmente en el laboratorio haciendo fluir partículas mixtas de PS (9–11,5 µm), PE no fluorescente (10–45 µm) y PE fluorescente (20–27 µm) suspendidas en desionizado (DI). ) agua en el canal. Tenga en cuenta que la fluorescencia solo se utilizó para diferenciar microplásticos visualmente, lo que proporciona un enfoque alternativo para reconocer microplásticos con fines de validación. Para ello, se mezclaron 10 mg de muestras de partículas en 200 ml de agua destilada y se inyectaron en el dispositivo con un caudal de 10 µl/min. Las microesferas se capturaron con éxito en trampas tipo tamiz del tamaño correspondiente, como se muestra en la Fig. 7d. Posteriormente, el dispositivo de microfluidos se retiró suavemente del dispositivo de sujeción y se utilizó para el análisis Raman.

Además de las pruebas en interiores, también se realizó la captura de microplásticos en una playa local para demostrar la viabilidad. El agua de mar superficial se filtró primero con tamices de 1 mm y 45 µm. La muestra de agua de mar recolectada se selló dentro de un balde de acero inoxidable completamente limpiado. El dispositivo de microfluidos se conectó al tubo de entrada y la salida se conectó a una jeringa vacía de 10 ml. La bomba de jeringa se configuró en modo de extracción para extraer agua de mar del cubo. Posteriormente, el dispositivo fue transportado de regreso al laboratorio para su posterior análisis. La configuración del experimento en la playa se muestra en la Fig. 8.

Se montó un experimento de muestreo in situ. Primero se filtró y recogió agua de mar. La bomba de jeringa fue alimentada por un banco de baterías para acampar y se ajustó al modo de extracción a un caudal de 10 µl/min. El experimento duró tres horas.

En este artículo, combinamos espectroscopía Raman, aprendizaje automático y microfluidos para desarrollar un novedoso dispositivo de microfluidos que atrapa microplásticos hasta varias micras y examinamos sistemáticamente el rendimiento de varios modelos de aprendizaje automático (es decir, SVM, RF, CNN y ResNet34) en identificación de microplásticos. La CNN y la SVM entrenadas pueden identificar partículas microplásticas prístinas con una precisión cercana al 100%. Además, los modelos también pueden identificar partículas microplásticas ambientales separadas del agua de mar con gran precisión. La capacidad de captura selectiva de tamaño del dispositivo beneficia enormemente una detección de microplásticos más precisa en el análisis Raman. En resumen, el proceso propuesto tiene un potencial significativo para el monitoreo y evaluación continuos y sin etiquetas a largo plazo de los microplásticos en el agua de mar. Además, este concepto puede adaptarse fácilmente para analizar otros tipos de micropartículas ambientales. Los esfuerzos de investigación futuros deberían concentrarse en ampliar continuamente el conjunto de datos mediante la incorporación de una gama más amplia de muestras ambientales. Además, es fundamental perfeccionar los modelos de aprendizaje profundo para mejorar la precisión y la solidez. Para los microplásticos gravemente degradados, se podría considerar una validación cruzada de los resultados de identificación y la integración de múltiples métodos de caracterización, como la espectrometría de masas y la espectroscopia de dispersión de energía. Además, la paralelización del dispositivo y la exploración de técnicas de separación alternativas pueden mejorar el rendimiento y la recuperación de partículas atrapadas para estudios posteriores.

Todos los datos relevantes están disponibles previa solicitud al autor correspondiente, Yang Lin, en [email protected].

Todo el código relevante está disponible previa solicitud al autor correspondiente, Yang Lin, en [email protected].

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Descargar referencias

Los datos Raman se adquirieron en el Consorcio de RI para Nanociencia y Nanotecnología, una instalación central de la Facultad de Ingeniería de URI parcialmente financiada por la Fundación Nacional de Ciencias EPSCoR, Acuerdo Cooperativo #OIA-1655221. El microscopio confocal Raman fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias EPSCoR, Acuerdo Cooperativo #OIA-1655221. Los autores quieren agradecer a Sarah Davis (asistente de investigación graduada en URI) por brindarnos un gran apoyo en los experimentos y compartir sus valiosos conocimientos sobre el muestreo ambiental de microplásticos del agua de mar. Agradecemos a Irene Andreu Blanco (Directora de Operaciones, Consorcio de Nanociencia y Nanotecnología de RI) y Zachary Shepard (Subgerente de Imaging Core Facility) por su constante apoyo, paciencia y orientación sobre el análisis Raman y las técnicas de identificación de microplásticos.

Departamento de Ingeniería Mecánica, Industrial y de Sistemas, Universidad de Rhode Island, Kingston, RI, EE. UU.

Liyuan Gong, Omar Martínez, Pedro Mesquita y Yang Lin

Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad de Rhode Island, Kingston, RI, EE. UU.

Kayla Kurtz

Departamento de Ciencias de la Computación, Universidad Estatal de San Diego, San Diego, CA, EE. UU.

Yang Xu

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

Conceptualización del estudio: YL, LG Preparación de muestras: LG, OM Recopilación de datos Raman: LG, OM Análisis de datos Raman: LG, OM, YL Desarrollo de modelos de aprendizaje automático: LG, OM Fabricación de dispositivos y experimentos: LG, OM Recolección de muestras in situ: LG, OM Interpretación de resultados: LG, YL, YX, OM Redacción de manuscritos: LG, YL Revisión de manuscritos: LG, PM, KK, YL, YX Revisión de manuscritos: LG, YL Supervisión de proyecto: YL

Correspondencia a Yang Lin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Gong, L., Martínez, O., Mesquita, P. et al. Un enfoque de microfluidos para la identificación sin etiquetas de microplásticos de pequeño tamaño en agua de mar. Representante científico 13, 11011 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37900-9

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Recibido: 18 de abril de 2023

Aceptado: 29 de junio de 2023

Publicado: 07 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37900-9

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