El aprendizaje automático y la metagenómica revelan perfiles de resistencia a los antimicrobianos compartidos en múltiples granjas de pollos y mataderos en China

Nature Food volumen 4, páginas 707–720 (2023)Cite este artículo

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China es el mayor consumidor mundial de antimicrobianos y mejorar los métodos de vigilancia podría ayudar a reducir la propagación de la resistencia a los antimicrobianos (RAM). Aquí informamos la vigilancia de diez granjas avícolas a gran escala y cuatro mataderos conectados en tres provincias chinas durante dos años y medio. Utilizando un enfoque de minería de datos basado en el aprendizaje automático, analizamos 461 microbiomas de aves, cadáveres y entornos, identificando 145 genes de resistencia a antibióticos (ARG) potencialmente móviles compartidos entre pollos y entornos en todas las granjas. Un conjunto central de 233 ARG y 186 especies microbianas extraídas del microbioma intestinal del pollo se correlacionaron con los perfiles de RAM de Escherichia coli que coloniza el mismo intestino, incluidos Arcobacter, Acinetobacter y Sphingobacterium, clínicamente relevantes para los humanos, y 38 ARG clínicamente relevantes. La temperatura y la humedad en los graneros también se correlacionaron con la presencia de ARG. Revelamos una intrincada red de correlaciones entre ambientes, comunidades microbianas y RAM, sugiriendo múltiples rutas para mejorar la vigilancia de la RAM en la producción ganadera.

El uso de antimicrobianos en la producción avícola en China es cinco veces mayor que el promedio internacional1. El uso de antibióticos, incluso en niveles bajos, altera y expande la resistencia intestinal en el ganado2, y la comunidad microbiana puede dar forma a los fenotipos de resistencia a los antimicrobianos (RAM)3. Eventos externos como cambios en la dieta, la temperatura y el estrés4,5 pueden resultar en la colonización de nuevas especies residentes o en la transferencia de RAM entre especies6. La temperatura, la humedad y la abundancia de especies bacterianas y la presencia de genes de resistencia a los antibióticos (ARG)7,8,9 pueden influir en la infección bacteriana en los pollos de engorde10. Los vínculos entre las condiciones ambientales y la RAM son particularmente relevantes para China y los países de ingresos bajos y medianos (PIMB), donde mantener condiciones ambientales estables en la agricultura a escala industrial puede ser un desafío en comparación con los países de ingresos altos11.

La vigilancia de la RAM en ámbitos no sanitarios no se ha adoptado ampliamente12, pero es clave para comprender cómo los sistemas de producción de alimentos contribuyen a la selección y diseminación de bacterias resistentes a los antibióticos (BRA) y ARG. El aprendizaje automático (ML) y la minería de big data ofrecen herramientas para avanzar en la avicultura de precisión13,14. Los enfoques basados ​​en cultivos que implican la secuenciación del genoma completo (WGS) de patógenos individuales, pruebas de susceptibilidad a los antibióticos y técnicas de ML son predictores eficaces de las características genómicas relacionadas con la resistencia a los antimicrobianos tanto para los aislados de Escherichia coli15,16,17,18 como para otras bacterias19,20,21,22 ,23,24. Sin embargo, los enfoques de vigilancia que se centran únicamente en WGS de patógenos individuales pueden no captar la diversidad de las comunidades microbianas y resistomas dentro de la producción ganadera y es posible que se pasen por alto los datos de ARG25. En un estudio reciente de prueba de concepto, observamos que varios ARG presentes en el resistoma fecal de pollo se correlacionaban con los perfiles de resistencia/susceptibilidad de aislados de E. coli cultivados a partir de las mismas muestras26.

En este estudio, desarrollamos un método de referencia para la vigilancia metagenómica dirigida a la ganadería china, donde la vigilancia de la RAM es particularmente desafiante, utilizando un enfoque que toma en consideración la falta de recursos de laboratorio que comúnmente se experimenta en China y los países de ingresos bajos y medianos27,28. Utilizamos E. coli como especie indicadora de resistencia a los antimicrobianos dentro del contexto más amplio de la comunidad microbiana que puebla el intestino del pollo. Para abordar contextos más amplios, exploramos los impactos en los microbiomas de los entornos agrícolas circundantes y conectados, la temperatura y la humedad del granero, y adoptamos protocolos de administración de antimicrobianos.

Se recolectaron muestras biológicas de diez granjas avícolas comerciales a gran escala (ver Métodos, Información complementaria, Fig. 1 complementaria y Tablas complementarias 1 y 2). Las comunidades microbianas y los ARG se diferenciaron entre las fuentes agrícolas y entre las granjas y el matadero (Información complementaria, Figuras complementarias 2 a 5 y Tablas complementarias 3 a 5). Como la movilidad genética puede influir en la presencia de ARG entre fuentes y debido a la importancia potencial de los elementos genéticos móviles (MGEs) en el desarrollo de sistemas de vigilancia eficaces29, buscamos ARG que estuvieran dentro de 5 kilobases (kb) de un MGE26 y consideramos estos MGE- Las combinaciones de ARG serán ARG potencialmente móviles. En total, se encontraron 661 combinaciones MGE-ARG diferentes (ARG potencialmente móviles), con 195 ARG únicos (Tabla complementaria 6). De estos, 75 ARG (38%) se encontraron en una sola combinación MGE-ARG, mientras que los 120 restantes (62%) se encontraron en múltiples combinaciones (2 a 22; Fig. 1a). Más de la mitad (56%) de los 661 ARG potencialmente móviles estaban presentes en más de una fuente (Fig. 1b), con tres combinaciones MGE-ARG (IS1216-poxtA, IS15-APH (3 ′) -Ia e ISCfr1-AAC ( 3)-IId) presente en todas las fuentes excepto en las plumas. Las heces de pollo tuvieron la mayor cantidad de ARG potencialmente móviles, pero también la mayor variación (Fig. 1c). Las plumas y el suelo del granero también contenían muchos ARG potencialmente móviles, el número medio estadísticamente equivalente a las heces (prueba de Dunn ajustada P > 0,05). El suelo exterior, los cadáveres, la línea de procesamiento y las aguas residuales generalmente tenían números más bajos de patrones de ARG potencialmente móviles por muestra, y estos números diferían significativamente (la prueba de Dunn ajustó P <0,01) de las heces y las plumas, pero no entre sí. En total, en las 10 granjas, se encontraron 145 combinaciones diferentes de MGE-ARG en fuentes ambientales y de aves en la misma granja, y algunas de ellas aparecieron en varias granjas. De estos, 46 contenían ARG clínicamente relevantes30 (Fig. 1d). En particular, encontramos blaNDM-5 en heces de pollo, plumas y muestras ambientales del suelo de graneros. Este gen se encuentra comúnmente en el plásmido IncX3, que puede diseminarse entre humanos, animales, alimentos y medio ambiente, aunque no confirmamos la presencia del plásmido en nuestros datos de secuenciación metagenómica de lectura corta (MGS). Otro gen importante y clínicamente relevante, qnrS1, se encontró en heces de pollo, plumas, suelo de granero ambiental y muestras de aguas residuales. Se sabe que este gen de resistencia a las quinolonas mediado por plásmidos está presente en la cadena de suministro del pollo y es capaz de transferirse a diferentes bacterias32.

a, Gráfico circular que muestra la proporción de ARG (de los 195 encontrados) asociados con uno o varios MGE. b, Gráfico de red no dirigida que muestra ARG potencialmente móviles (círculos naranjas pequeños) asociados con diferentes fuentes de muestra (círculos verdes grandes). Los bordes del gráfico vinculan los ARG potencialmente móviles con las fuentes en las que se encontraron. c, Número de ARG potencialmente móviles por muestra por fuente. Cada círculo representa una muestra única, con círculos coloreados por granja. d, diagrama de Venn que muestra que se encontró que 145 (de 661) ARG potencialmente móviles estaban presentes tanto en muestras de pollo como ambientales de la misma granja, y 182 ARG potencialmente móviles contenían ARG clínicamente relevantes. Se encontró una superposición de 46 30 ARG potencialmente móviles clínicamente relevantes en pollos y fuentes ambientales obtenidas de la misma granja. Tenga en cuenta que en este análisis, las muestras de la misma fuente recolectadas en t1 (semana 3) y t2 (semana 6) se agregaron, lo que llevó a un total de siete fuentes consideradas para cada granja.

Investigamos más a fondo si existía una correlación entre las especies bacterianas encontradas en el intestino del pollo, el resistoma (es decir, los ARG de todas las especies) y los perfiles de AMR de los aislados de E. coli tomados de las mismas muestras que los datos del metagenoma. Cultivamos aislados de E. coli de 170 muestras fecales de pollo (un subconjunto de las muestras que se habían utilizado para la metagenómica) y caracterizamos sus perfiles de RAM frente a un panel de 26 antibióticos. La proporción de aislados resistentes a cada antibiótico osciló entre el 1% y el 98% (Tabla complementaria 7). Todos los aislados fueron resistentes a al menos un antibiótico, y 169 fueron resistentes a al menos tres.

Para investigar las correlaciones entre la resistencia a los antibióticos en E. coli y el microbioma intestinal, desarrollamos un método de extracción de datos personalizado basado en ML (Fig. 2). El método consiste en construir una 'función predictiva' impulsada por ML cuya entrada es la agregación de información de la comunidad microbiana intestinal (abundancia relativa de especies microbianas) y el resistoma intestinal (recuento de ARG) y cuya salida es la resistencia de E. coli a un antibiótico específico (verdadero o falso) a partir de pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST). La función predictiva se entrenó utilizando datos experimentales (aprendizaje supervisado) e intercambiando diferentes tecnologías de aprendizaje automático subyacentes hasta lograr un rendimiento de predicción óptimo. De los modelos ML se extrajo un conjunto de las características más informativas, también denominadas "predictores". Luego, el conjunto se perfeccionó mediante el análisis de la correlación con la temperatura y la humedad (ver más adelante).

El flujo de trabajo de análisis de datos completo del método de minería de datos personalizado basado en ML. Los datos de entrada se muestran en verde. La fase I implica el preprocesamiento de datos del metagenoma (en amarillo). Los pasos se describen en detalle en la sección Métodos. La fase II implica el entrenamiento y prueba de funciones predictivas impulsadas por ML para aislar características metagenómicas (es decir, el recuento de ARG y la abundancia relativa de especies microbianas presentes en la muestra) correlacionadas con la resistencia fenotípica (en azul). La fase III implica ajustar modelos de regresión (que se analizan en la siguiente sección) para aislar características metagenómicas que se correlacionen mejor con las variaciones de temperatura y humedad (en rojo). AUC, área bajo la curva.

De los 26 antibióticos, sólo 17 tenían datos suficientes (casos de resistencia y susceptibilidad) para permitir un entrenamiento adecuado en ML: amikacina, amoxicilina-ácido clavulánico, aztreonam, cefepima, cefoxitina, cefotaxima-ácido clavulánico, ceftazidima, ceftazidima-ácido clavulánico, cloranfenicol, cefotaxima, gentamicina, kanamicina, minociclina, ácido nalidíxico, estreptomicina, sulfafurazol y trimetoprim-sulfametoxazol. Para todos, el mejor rendimiento de predicción (prueba de Nemenyi) se observó con el clasificador de árbol adicional (tecnología ML; Tabla complementaria 8 y Figura complementaria 6). Los indicadores de rendimiento de predicción calculados utilizando el método de árbol adicional se muestran en la Fig. 3a y en la Fig. 7 complementaria. Se lograron diez modelos predictivos (amikacina, aztreonam, cefoxitina, cloranfenicol, cefotaxima, kanamicina, ácido nalidíxico, estreptomicina, sulfafurazol y trimetoprim-sulfametoxazol). rendimientos superiores a AUC > 0,90.

a, Rendimiento de las funciones predictivas basadas en ML de la resistencia de E. coli a antibióticos específicos (tecnología ML: clasificador de árbol adicional; ver Métodos). Los indicadores de rendimiento (AUC, exactitud y precisión) se calcularon como el promedio de 30 iteraciones de validación cruzada anidada (ver Métodos). Consulte la figura complementaria 2 para conocer la sensibilidad, especificidad y la puntuación kappa de Cohen del indicador de rendimiento. Los gráficos de violín muestran la distribución de los datos, y cada punto de datos representa un modelo de antibiótico. Dentro de cada gráfico de violín hay un diagrama de caja, donde el cuadro muestra el rango intercuartil (IQR), los bigotes muestran el resto de la distribución como una proporción de 1,5 x IQR y el círculo blanco representa el valor mediano. b, Recuentos de características metagenómicas (ARG y especies microbianas) encontradas como los predictores más sólidos de los perfiles de resistencia/susceptibilidad de E. coli a cada antibiótico. c, Gráfico no dirigido que muestra los predictores más potentes (características metagenómicas en el intestino del pollo) para cada modelo de antibióticos. Los bordes del gráfico vinculan los nodos ARG o de especies de bacterias (variables predictivas) con el modelo de antibióticos en el que se encontró que eran predictivos. Tanto los nodos del modelo ARG como el de antibiótico están codificados por colores según la clase de antibiótico con la que se sabe que está asociado el antibiótico/ARG. Los modelos ML se ejecutaron para los siguientes antibióticos: amoxicilina-ácido clavulánico (AMC), amikacina (AMI), aztreonam (AZM), ceftazidima (CAZ), ceftazidima-ácido clavulánico (CAZ-C), cefotaxima (CTX), cefotaxima- ácido clavulánico (CTX-C), cefoxitina (CFX), cloranfenicol (CHL), cefepima (FEP), gentamicina (GEN), kanamicina (KAN), minociclina (MIN), ácido nalidíxico (NAL), estreptomicina (STR), sulfafurazol (SUL) y trimetoprim-sulfametoxazol (SXT). MDR, resistente a múltiples fármacos.

La extracción de datos mostró que un subconjunto central del resistoma del intestino de pollo (todos los ARG detectables de los datos metagenómicos de las heces de pollo) y las especies microbianas (todas las especies bacterianas de los datos metagenómicos de las heces de pollo) exhibieron un fuerte poder predictivo para la resistencia de E. coli. Este núcleo constaba de 419 características (186 especies microbianas y 233 ARG) que actúan como fuertes predictores de la resistencia/susceptibilidad de E. coli a 10 antibióticos (Fig. 3b, cy Tabla complementaria 9) con un AUC superior a 0,90. Los 233 ARG de los 10 principales modelos de antibióticos pertenecían a β-lactámicos (24 % de los ARG), aminoglucósidos (18 %) y macrólidos, lincosamidas y estreptogramina B (MLSB; 18 %), mientras que otras clases de antibióticos representaban menos del 10% cada uno. De estos 233 ARG, según la correlación de la profundidad de lectura de ARG con la abundancia de especies (ver Métodos) 33, se encontró que 46 estaban presentes en contigs identificados como originarios de E. coli. Otros 16 ARG (de los 233) estaban presentes sólo en contigs identificados como otras especies bacterianas (es decir, no se originaron a partir de E. coli). Para explorar más a fondo la relación entre las características intestinales centrales y la resistencia a los antibióticos, las 419 características y las 10 resistencias a los antibióticos se visualizaron como nodos de un gráfico, con bordes que solo conectan los predictores con las resistencias predichas (Fig. 3c). Este análisis destacó un núcleo de 66 ARG (15 clínicamente relevantes, incluidos blaNDM-5, blaCTX-M-15, dfrA15 y dfra5) que actúan como predictores de más de tres resistencias a antibióticos. Se descubrió que tres ARG (aphA6, vat(A) y vgb(A)) predecían ocho resistencias a antibióticos. El mismo análisis reveló 28 especies microbianas en el intestino que actúan como predictores de 5 resistencias a antibióticos (aztreonam, cloranfenicol, cefotaxima, kanamicina y ácido nalidíxico). Estas 28 especies incluían los géneros bacterianos Arcobacter, Acinetobacter y Sphingobacterium, además de otras bacterias comensales.

Se utilizaron valores de explicación aditiva de Shapley para explicar las características relacionadas con la AMR seleccionadas por ML (Figura complementaria 8). Las diez características más importantes encontradas para predecir la resistencia para cada modelo de antibiótico indicaron que el 41% de las características tenían su presencia asociada positivamente con la predicción de fenotipos resistentes, mientras que el 59% tenía su ausencia asociada positivamente con la predicción del fenotipo resistente, la mayoría en particular para los modelos antibióticos ácido nalidíxico y estreptomicina. Por el contrario, ocho de las diez características principales de cada modelo se asociaron negativamente con la predicción de la resistencia. El modelo de antibiótico cloranfenicol tenía el mayor número de ARG que se sabe que confieren resistencia a la misma clase de antibiótico (fenicol; optrA (ref. 34), lsaE (ref. 35) y mel (ref. 35)) o que se sabe que facilitan la resistencia a él. (oqxA (ref. 36)).

Para los diez principales modelos de antibióticos, desarrollamos modelos de regresión personalizados utilizando características intestinales individuales como variables independientes (un modelo por variable) y temperatura o humedad como variables dependientes para determinar si el ajuste del modelo resaltaría una correlación (consulte la fase III en la Fig. 2 y Métodos). La temperatura y la humedad se midieron en todas las granjas excepto en Liaoning 1 (LN1) durante un ciclo completo de producción de pollo (Tabla complementaria 10 y Figura complementaria 9). Entre las 419 características originales, 130 ARG y 48 especies microbianas se correlacionaron con la humedad, mientras que 39 ARG y 20 especies microbianas se correlacionaron con la temperatura (Figura complementaria 10 y Tabla complementaria 11). La correlación con la humedad fue, en promedio, más fuerte (valores de R2 más altos en el análisis de regresión, figura complementaria 10). De los 130 ARG correlacionados con la humedad, el 22% fueron MLSB, el 18% fueron β-lactámicos, el 17% fueron aminoglucósidos y el 11% fueron tetraciclinas. De los 39 ARG correlacionados con la temperatura, el 23% eran β-lactámicos, el 18% eran MLSB, el 15% eran aminoglucósidos y el 13% eran glicopéptidos. Diecinueve ARG se correlacionaron tanto con la temperatura como con la humedad, cuatro de ellos clínicamente relevantes (qnrA1, qnrS2, blaNDM-1 y catA8). Cuatro especies microbianas del filo Proteobacteria (Helicobacter pullorum y Alcaligenes faecalis), Firmicutes (grupo Bacillus cereus) y Bacteroidetes (Bacteroides stercoris) se correlacionaron con la temperatura y la humedad. Una especie de Tenericutes (Mycoplasma yeatsii) se correlacionó solo con la temperatura, mientras que otras especies de Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes y Actinobacteria se correlacionaron con la temperatura o la humedad (Tabla complementaria 11).

Probamos la posibilidad de que algunos ARG que estaban correlacionados con la temperatura o la humedad pudieran pertenecer a especies microbianas que también están correlacionadas con la temperatura y la humedad. Esto se hizo correlacionando la profundidad de lectura de ARG con la profundidad de lectura de especies microbianas como lo propusieron Tong et al.33. El análisis destacó dos subgráficos distintos correlacionados con la humedad (Fig. 4a) y uno correlacionado con la temperatura (Fig. 4b). En particular, uno de los subgráficos correlacionados con la humedad contenía Klebsiella pneumoniae y cuatro ARG relacionados (kpnE, kpnF, kpnG y acrA). El subgráfico que contiene A. faecalis y ARG vga(C) y blaOXA-58 se encontró en ambos análisis (es decir, se correlacionó tanto con la temperatura como con la humedad).

a, b, especies microbianas y ARG correlacionados con la humedad (a) y la temperatura (b). Las especies microbianas y los ARG están correlacionados con la humedad o la temperatura, y también entre sí, lo que indica que es probable que los ARG estén presentes en la especie. Las características se consideraron correlacionadas si las pendientes de las líneas de regresión lineal eran significativamente diferentes de cero (P <0,05 usando una prueba t bilateral). Los nodos indican ARG o especies microbianas; Los bordes conectan especies con ARG probablemente presentes en la especie. Los nodos ARG están codificados por colores según la clase de antibiótico que se sabe que está asociada con el ARG; Los nodos de especies microbianas se muestran en gris.

Luego investigamos si las características intestinales de ARG identificadas como predictores de resistencia en E. coli, y además identificadas como correlacionadas con la humedad o la temperatura, estaban muy cerca de las MGE. Se encontraron diez ARG ubicados muy cerca de MGE (MLSB: optrA, mph(F) y erm(X); β-lactámicos: blaNDM-1 y blaOXA-58; anfenicol: catA8 y catB2; aminoglucósido: aadA1; fluroquinolona: qnrS2 y qnrA1). Se encontró que tres de los diez ARG estaban asociados con solo un MGE (catB2 con ISPa25, mph(F) con IS15 y qnrA1 con IS15), mientras que los otros siete estaban asociados con dos a nueve MGE diferentes. Se investigó la estructura conservada de todos los pares MGE-ARG en granjas o fuentes. Por ejemplo, el blaNDM-1 clínicamente importante se encontró muy cerca de IS15 en cuatro muestras (tres heces de pollo de LN1 y una muestra de piso de granero de Liaoning 3 (LN3); Figura complementaria 11). En 19 muestras de heces de pollo y muestras de plumas de LN1, LN3, Shandong 2 (SD2) y Shandong 4 (SD4), se encontró blaNDM-1 cerca de MGE ISAba125 y ubicado junto a otro ARG, ble, que es una asociación conocida. para blaNDM-1 transmitido por plásmidos en especies de enterobacterias de regiones asiáticas37. A pesar de haber encontrado el mismo patrón blaNDM-1–ISAba125 en varias granjas (LN1, LN3, SD2 y SD4), no hubo evidencia de transmisión entre granjas (Fig. 5). En cambio, el análisis evolutivo de los cóntigos (utilizando un modelo de reloj molecular para predecir la tasa de evolución molecular en cada rama del árbol filogenético38) sugirió una ramificación reciente de aislados dentro de granjas individuales (el ancestro reciente más común (MCRA) de menos de 2 años en la mayoría de los casos). sucursales) y MRCA mucho más anteriores entre diferentes granjas (más de 20 años), lo que indica la probabilidad de que este ARG potencialmente móvil circule ampliamente en el ganado en toda China.

Árbol filogenético evolutivo bayesiano que reconstruye la filogenia de contigs que contienen los clínicamente importantes ARG blaNDM-1 y MGE ISAba125. Los ID de las muestras (por ejemplo, LNPCJFT2-17) se proporcionan en el árbol filogenético. El tipo de fuente y la ubicación de las muestras se indican mediante franjas de colores. La estructura genética de cada muestra se muestra debajo del árbol con los MGE de color azul, los ARG de color verde y otros genes de color amarillo. El ARG ble está ubicado junto con blaNDM-1 en todos los contigs.

Investigamos si el microbioma central del intestino del pollo previamente identificado como predictor de resistencia en E. coli puede a su vez estar asociado con el uso de antibióticos en las granjas (medido en función de si se usó o no una clase de antibiótico en la granja durante el período de estudio, Tabla complementaria 12; consulte la Información complementaria y la Figura complementaria 12 para obtener detalles adicionales). Descubrimos que el uso de tetraciclina, lincosamida o aminoglucósidos se asoció con recuentos alterados de 21 ARG y 20 especies microbianas (Información complementaria). También encontramos que 20 de los 21 ARG cuyos recuentos se correlacionaron significativamente con el uso de antibióticos (indicado en la Figura 13 complementaria) también se correlacionaron con la humedad. Además, uno de estos genes, erm(X), también se correlacionó con la temperatura. De las 20 especies microbianas que tuvieron una diferencia estadísticamente significativa en la abundancia relativa en relación con el uso de antibióticos (Tabla complementaria 13 y Fig. 14 complementaria), 7 se correlacionaron con cambios en la humedad (Wohlfafhrtiimonas chitiniclastica, Lachnoclostridium sp. An76, K . pneumoniae, Klebsiella variicola, Lysinibacillus sp. BF 4, Proteus hauseri y Proteus mirabilis) mientras que cuatro se correlacionaron con cambios de temperatura (Alistipes sp. An66, Lactobacillus aviarius, Enterococcus cecorum y Enorma massiliensis) con el grupo B. cereus correlacionado con ambos temperatura y humedad.

Los enfoques convencionales de vigilancia de la RAM no logran evaluar con precisión la diversidad bacteriana y de resistomas tanto dentro como entre granjas39. En nuestro estudio, utilizamos muestreo metagenómico a gran escala y aislamiento de E. coli en combinación con métodos estadísticos y de aprendizaje automático para extraer correlaciones complejas que muestren tendencias y patrones de RAM. E. coli tiene un papel establecido como indicador de referencia de AMR26. Encontramos que 38 ARG clínicamente relevantes se correlacionaban con la resistencia a múltiples antibióticos. Algunos de estos antibióticos no tenían asociación conocida previamente con estos ARG. En particular, 14 ARG (aadA16, aph(3′)-Ia, aph(3′)-VIa, blaCARB-16, catQ, dfrA15, dfrA16, dfrA27, blaOXA-58, blaPER-1, qnrD1, tet(Z) , tet(39) y blaSHV-110) que se asociaron con resistencia a la mayor cantidad de antibióticos se habían encontrado previamente en estudios anteriores en aves de corral en China40,41,42, lo que confirma nuestro método. Sin embargo, encontramos un grupo de bacterias intestinales que se correlacionaban bien con la resistencia de E. coli a cinco antibióticos diferentes. Estos incluían Arcobacter (un patógeno zoonótico emergente transmitido por el agua y los alimentos, responsable de gastroenteritis en humanos43), Acinetobacter (comensal en el intestino de las aves, pero capaz de causar enfermedades extraintestinales tanto en humanos como en aves de corral44) y Sphingobacterium (clínicamente relevante en humanos y animales45). Este resultado sugiere que, de acuerdo con estudios previos12,29,46,47,48,49,50, centrarse exclusivamente en E. coli dentro de la granja con fines de vigilancia puede no ser tan eficaz como monitorear un mayor número de patógenos.

En nuestro estudio, las granjas que utilizaron tetraciclinas, lincosamidas y polipéptidos se correlacionaron positivamente con la presencia de ARG de una amplia gama de clases, más allá de las específicas de los antibióticos seleccionados. Esto parece ser consistente con hallazgos anteriores51,52, pero contrasta con un estudio reciente de los Estados Unidos53. Es posible que la colocalización de genes de RAM esté desempeñando un papel importante en la selección de RAM en nuestras granjas. De hecho, la colocalización de genes de resistencia a los antimicrobianos en genomas bacterianos en animales destinados al consumo humano se ha observado y reconocido anteriormente como un problema de seguridad alimentaria en China54 y en otros lugares55,56.

Los pollos de nuestro estudio estaban alojados en cobertizos que no tenían un sistema de control climático eficaz y, por lo tanto, experimentaban variaciones sustanciales de temperatura y humedad. Nuestros resultados indican que las características centrales de la comunidad microbiana intestinal y el resistoma, que se correlacionan con la resistencia en E. coli, también se correlacionan con los cambios de temperatura y humedad en los gallineros. Nuestros resultados confirman y amplían los hallazgos de estudios anteriores7,8,9,26,57. Es de destacar que se encontró que la abundancia relativa de A. faecalis y los ARG vga (C) y blaOXA-58 originarios de esta especie (mediante el análisis de ARG y las profundidades de lectura de especies) estaban correlacionados con cambios tanto en temperatura como en humedad. Anteriormente se observó una mayor abundancia de A. faecalis y síntomas clínicos más graves en condiciones de mayor humedad en un estudio de casos y controles de pavos mantenidos a diferentes niveles de humedad e inoculados con A. faecalis58. Esta bacteria se encuentra comúnmente en las aves59 y normalmente no sería monitoreada mediante vigilancia convencional. Sin embargo, se considera un patógeno emergente, se ha asociado con infecciones en humanos y se considera difícil de tratar debido a su capacidad de volverse ampliamente resistente a los medicamentos60. De manera similar, se encontró que el importante patógeno oportunista K. pneumoniae y cuatro ARG (kpnE, kpnF, kpnG y acrA) que se originan a partir de esta bacteria e importantes para la resistencia de K. pneumoniae61 estaban correlacionados con los cambios en la humedad. K. pneumoniae puede transmitirse a través de la contaminación del aire y anteriormente se ha descubierto que tiene una mayor supervivencia en condiciones interiores de alta humedad, lo que destaca la importancia de estudiar esta bacteria en ambientes interiores62. Las asociaciones entre las variables ambientales (fácilmente monitoreables y controlables) y las especies y genes asociados con la RAM presentan oportunidades para el desarrollo de nuevas soluciones de monitoreo de la RAM, especialmente en los países de ingresos bajos y medianos donde estas variables no están controladas y representan un riesgo para los animales que están expuestos a cambios en ellos.

Se encontró que diez ARG potencialmente móviles en el resistoma intestinal se correlacionan con la resistencia de E. coli y con la temperatura y la humedad. Además, se encontró que 67 ARG potencialmente móviles se correlacionaban con la resistencia y la humedad de E. coli. Uno de ellos, el gen cfr(C), que codifica una ARN metiltransferasa ribosomal que confiere resistencia a los antibióticos linezolid y fenicol, se encontró cerca de ISEc9 (dentro de 5 kb) y está asociado con los genes CTX-M63,64 (como también encontramos). La asociación de drfA16 con la transposasa IS6100 se ha informado previamente en un solo estudio con una asociación con Corynebacterium diphtheriae, el agente causante de la difteria cutánea65. Estas asociaciones indican potencialmente una evolución específica del entorno de estos MGE, como se ha insinuado en trabajos previos en granjas porcinas que mostraron que la importancia de los MGE para la RAM variaba según la temporada66.

Aunque nuestro análisis se basó en un gran conjunto de muestras de muchas fuentes heterogéneas con variaciones geográficas y estacionales, nuestro alcance se limitó a E. coli, no consideró muestras humanas y se beneficiaría de extender el análisis a otras especies indicadoras como Enterococcus67. Las variaciones espaciales y temporales en las comunidades microbianas y resistomas de granjas/mataderos se reflejan en muestras fecales humanas, como lo han demostrado nuestro trabajo anterior y el de otros26,68, pero actualmente se desconoce si estas observaciones serían generalizables y globalmente verdaderas.

La secuenciación metagenómica tiene el potencial de ampliar nuestro conocimiento sobre los factores que impulsan la resistencia y mejorar la vigilancia de la RAM69. Los datos de secuenciación metagenómica son esenciales para desarrollar nuevas políticas de control de infecciones y resistencias, generar conciencia sobre la RAM y permitir el uso óptimo de antibióticos por parte de los profesionales veterinarios12,70. La MGS es muy prometedora para la vigilancia de la RAM en los sectores medioambientales, pero es necesario estandarizar las metodologías y colmar las lagunas de datos71,72, ya que actualmente son pocos los laboratorios y países que cuentan con los recursos y la experiencia necesarios para utilizar la MGS para la vigilancia de la RAM73. Con un mayor desarrollo, se podrían implementar enfoques metagenómicos y de aprendizaje automático para proporcionar predicciones rápidas y confiables de brotes de RAM, patógenos emergentes y rutas de transmisión69.

A pesar de la creciente disponibilidad de metagenómica y tecnologías de agricultura de precisión de bajo costo29,74, la innovación y los avances metodológicos deben permitir aún más el desarrollo de soluciones de vigilancia capaces de monitorear la dinámica de la RAM12,29. La resistencia a los medicamentos surge de interacciones complejas entre BRA, comunidades microbianas, nichos y entornos geográficos, fuerzas evolutivas, clima y prácticas humanas. Hemos demostrado cómo se pueden desarrollar metodologías que sean capaces de asociar una amplia gama de especies microbianas y genes con resistencia a los antimicrobianos observable, y hemos evaluado además cómo se asocian con las variables ambientales de temperatura y humedad. La consideración de todos los conjuntos de datos relevantes e interconectados sobre la RAM en un enfoque de 360° impulsará nuestra comprensión y control de la propagación de la RAM.

Este estudio cumplió con todas las regulaciones éticas relevantes y se realizó específicamente de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética del Laboratorio Estatal Clave del Centro Nacional de China para la Evaluación de Riesgos de Seguridad Alimentaria (número de aprobación ética: 2018018). También se obtuvo la aprobación ética del Comité de Ética en Investigación de la Facultad de Medicina y Ciencias Veterinarias de la Universidad de Nottingham (número de identificación de la solicitud: 2340 180613).

Para este estudio, seleccionamos diez granjas avícolas comerciales a gran escala en tres provincias diferentes de China (Shandong, Henan y Liaoning; en adelante, las granjas se denominarán SDx, HNx y LNx, respectivamente), cubriendo un área de 472.500 km2, cada granja alimentando a uno de los cuatro mataderos regionales (dos en Henan, uno en Liaoning y uno en Shandong). Cada granja contaba con varios graneros, cada granero contenía entre 12.000 y 32.800 aves, lo que generaba una capacidad de producción total de 110.730 a 380.000 aves por ciclo de reproducción (dependiendo de la granja). La producción de pollos de engorde se basó en la autocría, con pollos criados en la granja y trasladados a graneros en lotes de la misma edad. De las diez granjas seleccionadas, cuatro (tres en Liaoning y una en Shandong) utilizaron sistemas de alojamiento en red, mientras que las otras seis utilizaron sistemas de alojamiento en jaulas. Durante la recolección, el número de aves por establo no difirió significativamente entre los dos sistemas de alojamiento (prueba t, P = 0,07).

El muestreo siguió a las mismas aves agrupadas durante un ciclo de reproducción, excepto en una granja en la provincia de Shandong (Shandong 1), que fue muestreada durante dos ciclos para realizar un estudio piloto para afinar la campaña de recolección y los protocolos de análisis de datos26. Se recolectaron muestras biológicas en los mismos tres momentos en cada ciclo de reproducción (incluidos ambos ciclos en Shandong 1): t1 (semana 3), t2 (semana 6) y t3 (1 a 5 días después de la semana 6). Las muestras biológicas consistieron en heces y plumas acumuladas (no necesariamente de los mismos animales) procedentes de excrementos de aves vivas en los graneros, recogidas del suelo del granero inmediatamente después de la excreción en la mitad de su vida (t1) y al final de su vida (t2) los animales, así como las muestras del suelo del granero (basura) recogidas en los mismos momentos. En los mataderos, se recogieron muestras el día del sacrificio (t3) de las canales, las superficies de procesamiento de la carne (denominadas línea de procesamiento) y las aguas residuales. Se recolectaron muestras de suelo de áreas exteriores que rodean las fincas en t1 y t2. Los detalles de los métodos de recopilación están disponibles en la Información complementaria.

Todas las granjas involucradas en este estudio estaban equipadas con sistemas de calefacción/aire acondicionado. Los datos de los sensores ambientales (temperatura y humedad) se recolectaron a intervalos de 5 minutos utilizando los sensores automatizados y registradores de datos disponibles en la mayoría de las granjas (HN1, HN2, HN3, SD2, SD3 y SD4). Tres granjas (SD1, LN2 y LN3) no estaban equipadas con soluciones automatizadas y las mediciones manuales se realizaron utilizando dispositivos de temperatura/humedad SMART SENSOR AS837, ya sea diariamente o cada 6 h. La granja LN1 tuvo problemas técnicos con el sensor y no adquirió ninguna medida. En todos los casos, los datos de temperatura y humedad se promediaron a partir de tres mediciones tomadas en diferentes lugares dentro del granero.

La extracción de ADN se realizó en heces, suelo de granero y muestras de suelo exterior utilizando un kit de extracción de ADN genómico con perlas magnéticas (DOP336-T3, TIANGEN Biotech). Para las muestras de canales se utilizó el método del bromuro de cetiltrimetilamonio75. Se utilizaron muestras con un contenido de ADN superior a 1 µg para construir la biblioteca de ADN. La concentración de ADN se midió utilizando un kit de ensayo Qubit dsDNA y un fluorómetro Qubit 2.0 (LifeTechnologies), y la integridad se midió mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se utilizó una cantidad total de 1 μg de ADN por muestra como material de entrada para las preparaciones de muestras de ADN. Las bibliotecas de secuenciación se generaron utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra para Illumina (NEB). La muestra de ADN se fragmentó en 350 pb y luego los fragmentos de ADN se pulieron en los extremos, se les dio una cola en A y se ligaron con el adaptador de longitud completa para la secuenciación de Illumina con análisis de PCR adicionales. Finalmente, los productos de la PCR se purificaron (AMPureXPsystem) y las bibliotecas se analizaron para determinar su distribución de tamaño utilizando un bioanalizador Agilent2100 (Agilent Technologies) y se cuantificaron mediante PCR en tiempo real. Después de la generación de grupos, las preparaciones de la biblioteca se secuenciaron en una plataforma Illumina Novaseq 6000 y se produjeron lecturas de extremos emparejados de 150 pb.

Las lecturas de secuencia sin procesar, obtenidas de la plataforma de secuenciación Illumina HiSeq, se preprocesaron y filtraron utilizando Readfq (V8, https://github.com/cjfields/readfq) para adquirir datos de alta calidad para análisis posteriores. El ADN del huésped se filtró utilizando Bowtie 2 (v2.3.4.1) 76 y SAMtools (v1.9 (ref. 77); código de acceso al genoma de referencia: GCF_000002315.6). Los microbiomas de las muestras se construyeron reuniendo los datos de secuenciación del metagenoma para las diferentes fuentes de muestras (heces de pollo, plumas de pollo, cadáveres de pollo, piso de granero, suelo exterior, aguas residuales y línea de procesamiento) por separado utilizando tuberías de agrupamiento y desreplicación26,78. Para ensamblar las secuencias se utilizó el software MEGAHIT (v1.1.2)79. Se generaron conjuntos de muestra única para todas las muestras con parámetros predeterminados de MEGAHIT. Se generaron coensamblajes para cada grupo de fuentes de muestra (heces de pollo, plumas de pollo, canales de pollo, piso de granero, suelo exterior, aguas residuales y línea de procesamiento), cada uno con los parámetros de configuración MEGAHIT “--continuar --kmin-1paso --min -contig-len 1000” como se usaba anteriormente para conjuntos78. Los contigs filtrados (>2000 pb) se asignaron a ensamblajes y coensamblajes individuales utilizando Burrows–Wheeler Aligner–Maximal Exact Match (BWA-MEM v2-2.1)80 y SAMtools (v1.9)77 para producir el mapa de alineación binaria (BAM). ) archivos. Se utilizó METABAT2 (v2.15)81 para obtener la profundidad de cobertura. La clasificación taxonómica y la composición (abundancia relativa de especies) de las lecturas del metagenoma se perfilaron utilizando MetaPhlAn (v3.0)82 con Bowtie 2 (v2.3.4.1)76 utilizando la configuración predeterminada –bowtie2out–input_type fastq. El escalado multidimensional no métrico (NMDS) de la abundancia relativa de especies se realizó en R (v3.6.2) utilizando el paquete vegan83 con disimilitud de Bray-Curtis. El análisis de varianza se realizó en R utilizando PERMANOVA del paquete vegano83 con pruebas por pares utilizando la función Adonis por pares84 con corrección de Holm para comparaciones múltiples. Las abundancias relativas se analizaron visualmente combinando gráficos de violín y gráficos de dispersión categóricos, y las diferencias se evaluaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de Holm (P ajustada = 0,05).

Como la profundidad de la secuenciación puede afectar la diversidad observada en la secuenciación genómica, la rarefacción se utiliza ampliamente para normalizar muestras antes del análisis en diferentes tipos de muestras85. Sin embargo, el uso de la rarefacción es controvertido ya que el submuestreo conduce a la pérdida de información disponible en la muestra no enrarecida86. Por lo tanto, en este estudio utilizamos datos enrarecidos solo cuando fue necesario (para comparar diferentes tipos de muestras) y datos no enrarecidos cuando solo se consideraba un único tipo de muestra. Las lecturas eliminadas por el host se enrarecieron utilizando la profundidad de muestra mínima usando seqtk (https://github.com/lh3/seqtk), con la semilla aleatoria fija para cada par de lecturas.

Se buscaron genomas ensamblados en busca de similitud de secuencia con los ARG anotados presentes en la Base de datos integral de resistencia a los antibióticos (CARD)61 utilizando la herramienta de búsqueda de alineación local básica-nucleótido (BLASTn)87 ​​con un umbral de identidad del 95% y un umbral de cobertura del 95% (umbrales más estrictos con con respecto a nuestro estudio anterior26) para minimizar la probabilidad de variantes de ARG mal etiquetadas. El análisis NMDS se realizó en la matriz de recuento de genes resultante en el paquete vegan R83 utilizando la disimilitud de Bray-Curtis. Las comparaciones se realizaron utilizando (1) el número total de ARG presentes por muestra, (2) el recuento real de ARG individuales por muestra y (3) la abundancia relativa de ARG por clase de antibiótico según CARD (el número de ARG presentes en la muestra dividido por el número total de ARG en esa clase). Estos tres enfoques se analizaron visualmente combinando gráficos de violín y gráficos de dispersión categóricos, y las diferencias se evaluaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de Holm (P ajustada = 0,05).

Para identificar la fuente bacteriana a partir de la cual se originaron los ARG, de acuerdo con un estudio previo33, se mapearon lecturas enrarecidas de cada muestra de metagenoma en sus ensamblajes individuales utilizando BWA-MEM (v2-2.1)80 y SAMtools (v1.9)77. Las profundidades promedio se asignaron a los contigs y ARG que transportan ARG. La cobertura de ARG, normalizada por la longitud del gen/cóntig33, se utilizó luego para correlacionar con la abundancia de especies mediante la prueba de correlación de Spearman. Los pares ARG-especies se consideraron significativamente correlacionados si P <0,05 y el coeficiente de correlación de Pearson ≥ 0,6.

Para buscar la presencia de ARG potencialmente móviles compartidos entre diferentes fuentes, se consideraron los ARG transportados tanto por el medio ambiente como por los pollos. Se buscaron ARG y MGE en los contigs filtrados (> 500 pb) en cada ensamblaje mediante una búsqueda BLASTn en las bases de datos CARD61 e ISfinder (https://isfinder.biotoul.fr/) utilizando un umbral de identidad del 95% y un umbral de cobertura de 95. % para evitar falsos positivos e incertidumbre sobre variantes88. La distancia entre un ARG y un MGE se calculó a partir de las posiciones de ARG y MGE en el contig26. Se descartaron los contigs portadores de ARG con una distancia de más de 5 kb entre ARG y MGE68,89,90,91, y los contigs restantes se clasificaron como ARG potencialmente móviles. Los contigs se anotaron utilizando Prokka (v1.14.6)92. Los patrones ARG potencialmente móviles encontrados en una sola muestra se descontaron en el análisis. Los ARG se clasificaron además como clínicamente importantes si se incluían en la categoría Riesgo I (conjunto de datos de ARG clínicamente importantes) según Zhang et al.30. Estos genes se clasificaron como Riesgo I si estaban (1) presentes en ambientes asociados con humanos, (2) genes potencialmente móviles y (3) presentes en patógenos ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y especies de enterobacterias). Las estructuras de los patrones de ARG potencialmente móviles (tipo de MGE, ARG transportado, MGE transportado, fuente de muestra, granja, número de muestras que transportan ARG potencialmente móviles y distancia) se resumen en la Tabla complementaria 8. Para ISAba125-blaNDM-1, la estructura del gen Se visualizó utilizando EasyFig93.

Se reconstruyó la filogenia evolutiva de los cóntigos que portan el ARG ISAba125–NDM-1 potencialmente móvil utilizando BEAST (v1.10.4)38. Todas las combinaciones de tres modelos de reloj (estricto, logarítmico normal no correlacionado y exponencial no correlacionado) y tres árboles anteriores (coaliscente constante, crecimiento logístico y horizonte bayesiano) se probaron utilizando un muestreo gradual en los contigs para identificar el mejor modelo. Se descubrió que el mejor modelo era un modelo de reloj log-normal aleatorio no correlacionado con un modelo de crecimiento del horizonte bayesiano. Se utilizó el modelo de sustitución de nucleótidos gamma-GTR, seleccionado mediante un análisis de árbol de máxima verosimilitud en IQ-tree2 (v2.0.6) mediante selección de modelo automatizada94. El análisis se realizó para tres cadenas independientes hasta que el tamaño de muestra efectivo, es decir, el número efectivo de extracciones independientes de la distribución posterior, para todos los parámetros fue superior a 200 por cadena. Esto implicaba que cada cadena tuviera 100 millones de pasos. La convergencia se evaluó en Tracer (v1.7.1)95 y las cadenas se combinaron posteriormente utilizando LogCombiner (v1.10.4)96. El árbol de máxima credibilidad del clado se seleccionó utilizando TreeAnnotator (v1.10.4) y luego se visualizó en iTOL (v5)97.

Se tomaron cepas de E. coli de las mismas muestras que los datos del metagenoma del intestino de pollo, se cultivaron y se utilizaron como especies indicadoras de AMR98 para cada muestra de heces de pollo (consulte la Información complementaria para obtener detalles sobre el cultivo y la metodología AST). Sólo 191 de las 223 muestras dieron positivo para un aislado de E. coli. De estas 191 muestras, otras 21 (de LN1) se descartaron de este análisis debido a problemas técnicos con los sensores ambientales que provocaron que estas muestras no tuvieran los datos de temperatura y humedad necesarios para el oleoducto ML. Por lo tanto, quedaban 170 muestras por analizar en el proceso de ML.

Los perfiles de susceptibilidad/resistencia a los antibióticos de las cepas de E. coli se evaluaron frente a un panel de 26 antibióticos (Tabla complementaria 1) utilizando microdilución en caldo y se interpretaron de acuerdo con los criterios del Clinical and Laboratory Standards Institute99. El proceso general de análisis de datos, implementado en Python (v3.9.15)100 y SciPy (v1.9.3)101, constaba de tres fases (Fig. 2):

Fase I: preselección de características metagenómicas. Para cada antibiótico, aislamiento de un primer conjunto de características del metagenoma fecal (es decir, recuentos de ARG y abundancia relativa de especies microbianas) que muestran correlación con los perfiles de resistencia/susceptibilidad de E. coli según una prueba de chi-cuadrado.

Fase II: evaluación del poder de predicción de la característica mediante el desarrollo de funciones predictivas impulsadas por ML. Desarrollo de funciones predictivas de resistencia/susceptibilidad basadas en ML (una función predictiva por antibiótico) que operan a partir de las características preseleccionadas (consulte a continuación para obtener más detalles), capacitación supervisada con muestras disponibles y luego inspección del estado de mejor ajuste de cada una. Función predictiva para recuperar la influencia predictiva de cada característica, es decir, el peso relativo de la característica para impulsar el resultado de la predicción.

Fase III: evaluación de la dependencia de las características de la temperatura/humedad mediante el desarrollo de regresores impulsados ​​por ML. Desarrollo de regresores basados ​​en ML para identificar correlaciones entre el conjunto de características del metagenoma fecal identificadas en la fase II y las condiciones de temperatura/humedad.

Las tres fases se describen en detalle a continuación.

Se consideró un conjunto inicial de características para cada uno de los 26 antibióticos y comprendía todos los datos sobre el recuento de ARG y la abundancia de especies microbianas en el metagenoma fecal. Se aplicaron los siguientes pasos para procesar y reducir dichos conjuntos utilizando el paquete Python Scikit-learn102:

Las abundancias se convirtieron en abundancias relativas (rango 0-1) utilizando la normalización mínima-máxima.

Para cada antibiótico específico, los desequilibrios en el tamaño de la muestra entre las observaciones de resistencia y susceptibilidad se compensaron con datos generados sintéticamente utilizando la técnica de sobremuestreo de minoría sintética (SMOTE)103, adoptando los cinco vecinos más cercanos como parámetro predeterminado.

Las características (recuento de ARG y abundancia relativa de especies) con una varianza igual a cero (es decir, características que tenían el mismo valor en todas las muestras) se eliminaron por ser redundantes (incapaces de actuar como predictores efectivos).

Se eliminaron las características que no mostraron una fuerte asociación con el resultado de la predicción (perfil de resistencia/susceptibilidad), según una prueba de chi-cuadrado (se eliminaron todas las características con un valor de P superior a 0,01). No se utilizó ninguna corrección de comparación múltiple ya que buscábamos evaluar cada característica por sí sola104.

El conjunto restante de características se sometió a inspección visual mediante una representación gráfica diseñada para crear grupos espaciales que resaltan la correlación. El análisis se realizó utilizando la biblioteca NetworkX105 en Python. En el gráfico resultante, los nodos que representan características (recuento de ARG o abundancia relativa de especies) están conectados a nodos que representan resistencia/susceptibilidad a un antibiótico específico si la existencia de una correlación ha sido demostrada mediante la prueba de chi-cuadrado (consulte el paso anterior). . Los nodos se organizaron espacialmente utilizando la función de costo de longitud del camino Kamada-Kawai106.

Se desarrollaron y probaron funciones predictivas basadas en múltiples tecnologías de aprendizaje automático subyacentes, cada una de ellas entrenada para predecir la resistencia/susceptibilidad a un antibiótico específico, utilizando las características preseleccionadas en la Fase I como entrada de aprendizaje supervisado. Se entrenó y validó una función predictiva para cada uno de los 26 antibióticos probados. Tras el entrenamiento y la validación exitosos, la inspección del estado de mejor ajuste de cada función predictiva permitió la recuperación de la influencia cuantitativa de cada característica (es decir, el peso relativo) en relación con la predicción de la resistencia/susceptibilidad a cada antibiótico.

Se probaron las siguientes tecnologías de aprendizaje automático para la implementación de funciones predictivas: regresión logística, máquina de vectores de soporte lineal, máquina de vectores de soporte con función de base radial, clasificador de árbol adicional, bosque aleatorio, Adaboost y XGBoost, todas implementadas utilizando el paquete Python Scikit-learn102. Se utilizó la validación cruzada anidada (NCV)107 para evaluar el rendimiento y seleccionar los hiperparámetros óptimos para cada tecnología. NCV es un procedimiento iterativo en el que se prueba repetidamente el rendimiento de diferentes configuraciones de la función predictiva (es decir, diferentes hiperparámetros que impulsan la tecnología seleccionada) mientras se reorganizan los conjuntos de entrenamiento y prueba. NCV consta de un bucle externo dedicado a reasignar aleatoriamente observaciones en nuevos conjuntos de entrenamiento y prueba, y un bucle interno donde se prueban diferentes configuraciones (conjuntos de hiperparámetros) para la función predictiva con el conjunto de entrenamiento y prueba actual. En nuestro análisis, ejecutamos un NCV con un bucle externo quíntuple (cinco reorganizaciones de los conjuntos de entrenamiento y prueba) y un bucle interno triple (tres reorganizaciones del conjunto de entrenamiento) para cada tecnología de ML diferente. El rendimiento de la predicción se midió mediante el área característica operativa del receptor bajo la curva (ROC-AUC, denominada simplemente AUC en lo sucesivo), la exactitud, la sensibilidad, la especificidad y la precisión, todo calculado en cada iteración del bucle externo108. Se completaron treinta iteraciones de las evaluaciones NCV para cada tecnología de ML. Luego se compararon las tecnologías ejecutando una prueba F sobre los resultados cuantitativos medios para cada una utilizando la métrica AUC. Se requirió un mínimo de 12 muestras de la clase minoritaria para la clasificación de SMOTE y NCV. Nueve antibióticos (ampicilina, ampicilina-sulbactam, cefazolina, ciprofloxacina, doxiciclina, imipenem, levofloxacina, meropenem y tetraciclina) carecían de muestras suficientes en una clase para permitir la validación cruzada y SMOTE, por lo que no se tomaron más. Comparamos las siete arquitecturas de ML para evitar sesgos en el análisis relacionado con la elección de una tecnología de ML específica. El rendimiento de la predicción se midió mediante 30 iteraciones de NCV, y la puntuación de rendimiento final se definió como la media de todas las ejecuciones. La prueba de Nemenyi se utilizó para verificar qué función predictiva funcionó mejor entre los siete métodos de ML. Las funciones predictivas del árbol adicional obtuvieron las mejores calificaciones según todos los indicadores de rendimiento estudiados, aparte de la sensibilidad (donde todas las funciones predictivas se consideraron estadísticamente equivalentes) y finalmente se seleccionaron para producir los resultados de correlación. Como se seleccionó el método de árbol adicional para potenciar las funciones predictivas finales, se utilizó la importancia de Gini para extraer los predictores más sólidos de los modelos finales entrenados.

La última fase del análisis consistió en el desarrollo de modelos de regresión para identificar correlaciones entre el conjunto de características del metagenoma fecal identificadas en la Fase II (predictores) y las condiciones de temperatura/humedad. Solo se consideraron los predictores extraídos de modelos basados ​​en ML con AUC > 0,9.

Se creó un modelo de regresión separado para representar la relación de cada predictor (considerado como la variable de entrada/explicativa) con la temperatura o la humedad (considerada como la variable dependiente). El predictor se trató como continuo si se relacionaba con una abundancia microbiana relativa o con un recuento de ARG. Se recogieron valores de temperatura y humedad en cada granja y se promediaron los 7 días anteriores a los dos puntos temporales t1 y t2.

Cada modelo de regresión se desarrolló mediante un ajuste lineal de mínimos cuadrados (utilizando el paquete Python SciPy101) utilizando el coeficiente de determinación (r2) para evaluar la bondad del ajuste. Se consideró que las características del metagenoma estaban significativamente correlacionadas con la temperatura o la humedad si la pendiente de la línea de regresión difería estadísticamente de cero (P <0,05 utilizando la prueba de Wald con distribución t de la estadística de prueba). Buscamos correlaciones entre la profundidad de lectura de ARG y la profundidad de lectura de especies, lo que indicaría la probabilidad de que los ARG se originen en una especie en particular, como propone Tong et al.33. Se creó un gráfico no dirigido utilizando NetworkX (v2.8.4)105 para visualizar los ARG interconectados y las especies seleccionadas por el marco de regresión para humedad y temperatura.

Las correlaciones observadas entre los datos metagenómicos en las heces de pollo y los perfiles de resistencia observados en E. coli pueden verse influenciados por los diferentes protocolos de antibióticos que adoptó cada granja (Tabla complementaria 13). Para identificar si las diferencias en el tratamiento con antibióticos en cada granja condujeron a un sesgo en las características metagenómicas seleccionadas, calculamos la abundancia relativa de ARG expresada agrupando primero los ARG por relación con cada antibiótico específico y luego calculando las proporciones de ARG presentes en la muestra. , dividido por el número total de ARG para cada antibiótico, y luego calculó la abundancia relativa de las especies microbianas. Para estos tres casos, utilizamos la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para verificar si había una diferencia entre las muestras de las granjas que recibieron un antibiótico y las muestras que no recibieron ese antibiótico.

Para obtener detalles de todos los análisis estadísticos, consulte la Información complementaria.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación metagenómica que respaldan las conclusiones de este artículo están disponibles en la base de datos del NCBI con los números de acceso de Bioproject PRJNA678871 (para Shandong 1_1 y 1_2) y PRJNA841806 (para todas las demás granjas). Además, el genoma de referencia utilizado para filtrar el ADN del huésped está disponible en la base de datos NBCI con el código de acceso GCF_000002315.6. Todos los datos de origen necesarios para recrear las figuras se proporcionan en los Datos complementarios 1.

El código está disponible a través de Github en https://github.com/tan0101/Commercial_MGS2023. El código se utilizó para la clasificación del aprendizaje automático, el análisis de regresión y el análisis de red.

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Este trabajo fue apoyado por InnovateUK (subvención n.° 104986), FARMWATCH: Fight AbR with Machine learning and a Wide Array of sensing TeCHnologies (TD y DR) y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República Popular China a través de Grant Key. Proyecto de Cooperación Internacional en Innovación Científica y Tecnológica entre Gobiernos (número 2018YFE0101500, ZP). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Los autores agradecen el apoyo recibido de la Universidad de Nottingham Research Beacon of Excellence: Future Food y del oficial de seguimiento de Innovate UK, L. Viatge, por su apoyo.

Estos autores contribuyeron igualmente: Michelle Baker, Xibin Zhang, Alexandre Maciel-Guerra.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Zixin Peng, Fengqin Li, Tania Dottorini.

Facultad de Medicina y Ciencias Veterinarias, Universidad de Nottingham, Sutton Bonington, Reino Unido

Michelle Baker, Alexandre Maciel-Guerra, Yue Hu y Tania Dottorini

Shandong New Hope Liuhe Group Co. Ltd y Qingdao Key Laboratory of Animal Feed Safety, Qingdao, República Popular de China

Xibin Zhang

Laboratorio clave del NHC para la evaluación de riesgos de inocuidad de los alimentos, Centro Nacional de China para la evaluación de riesgos de inocuidad de los alimentos, Beijing, República Popular de China

Yinping Dong, Wei Wang, Yujie Hu, Junshi Chen, Zixin Peng y Fengqin Li

Nimrod Veterinary Products Ltd., Moreton-in-Marsh, Reino Unido

David Renney

Shandong Kaijia Food Co., Weifang, República Popular China

Long Hai Liu

Centro de Luoyang para el Control y la Prevención de Enfermedades, ciudad de Luoyang, República Popular de China

Hui Li y Zhiqin Tong

Centro Provincial de Liaoning para el Control y la Prevención de Enfermedades, ciudad de Shenyang, República Popular China

Meimei Zhang y Yingzhi Geng

Laboratorio Biofarmacéutico Agrícola, Facultad de Química y Ciencias Farmacéuticas, Universidad Agrícola de Qingdao, Ciudad de Qingdao, República Popular China

Li Zhao

Centro de Innovación en Medicina Veterinaria de China, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Agrícola de China, Ciudad de Beijing, República Popular de China

Zhihui Hao

Departamento de Ingeniería, Universidad de Perugia, Perugia, Italia

Nicola tuya

Centro de Investigación de Alimentos Inteligentes, Nottingham Ningbo China Instituto de Investigación e Innovación Beacons of Excellence, Universidad de Nottingham Ningbo China, Ningbo, República Popular China

Tania Dottorini

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JC, FL, ZP, XZ, LL y TD diseñaron y supervisaron el estudio; ZP, XZ, LL, FL, JC y TD planificaron la metodología; MB, AMG, NS y TD redactaron el borrador; ZP, JC, FL, MB, AMG, NS y TD editaron y revisaron el borrador y proporcionaron comentarios críticos; ZP, WW, YD, Yujie Hu, HL, ZT, MZ, YG, LZ, ZH y XZ llevaron a cabo los experimentos y recogieron muestras animales y ambientales; AMG, MB y Yue Hu realizaron el análisis de datos y la visualización de los datos analizados con comentarios críticos de NS y TD; ZP, DR y TD adquirieron la financiación. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Zixin Peng, Fengqin Li o Tania Dottorini.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Food agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Objetivos, resultados y métodos de la investigación complementaria, figs. 1–14 y lista de tablas.

Tablas complementarias 1 a 13.

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Baker, M., Zhang, X., Maciel-Guerra, A. et al. El aprendizaje automático y la metagenómica revelan perfiles de resistencia a los antimicrobianos compartidos en múltiples granjas de pollos y mataderos en China. Alimentos naturales 4, 707–720 (2023). https://doi.org/10.1038/s43016-023-00814-w

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Recibido: 09 de enero de 2023

Aceptado: 07 de julio de 2023

Publicado: 10 de agosto de 2023

Fecha de emisión: agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43016-023-00814-w

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