Dos regulados dinámicamente

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4977 (2023) Citar este artículo

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Muchos virus de ARN emplean sitios internos de entrada a ribosomas (IRES) en su ARN genómico para controlar la maquinaria de traducción del huésped para su replicación. El IRES del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) interactúa con el factor de iniciación de la traducción eucariota 4 G (eIF4G), reclutando la subunidad ribosómica para la traducción. Aquí, analizamos la estructura tridimensional del complejo compuesto por EMCV IRES, el fragmento del dominio HEAT1 de eIF4G y eIF4A, mediante microscopía crioelectrónica. Se identifican dos dominios distintos que interactúan con eIF4G en el IRES y la formación compleja cambia el ángulo entre ellos. Además, exploramos la dinámica de estos dominios mediante el uso de espectroscopia de RMN en solución, lo que revela equilibrios conformacionales en una escala de tiempo de microsegundos a milisegundos. En las conformaciones poco pobladas, el registro de emparejamiento de bases de un dominio se desplaza con la transición estructural de la unión de tres vías, como en la estructura compleja. Nuestro estudio proporciona información sobre la sofisticada estrategia del ARN viral para un acoplamiento óptimo para secuestrar la proteína huésped.

Los virus de ARN subvierten la maquinaria de traducción del huésped para activar los ribosomas celulares, lo cual es esencial para promover la traducción del genoma viral para la replicación1,2,3,4. Uno de esos mecanismos utiliza sitios de entrada de ribosomas internos (IRES) en las regiones 5 'no traducidas del genoma de ARN, que controlan la maquinaria traduccional del huésped a través de múltiples interacciones ARN-ARN y/o ARN-proteína. Por tanto, la regulación de la traducción dependiente de IRES es un paso crítico para la infección y replicación de estos virus, con múltiples efectos sobre la virulencia, el tropismo tisular y la patogenicidad2. Además, algunos ARNm de células eucariotas también pueden aprovechar el mecanismo de traducción dependiente de IRES para regular procesos como el desarrollo y las respuestas al estrés celular3,4.

Los IRES son elementos de ARN que actúan en cis y que normalmente adoptan estructuras tridimensionales, ya sea para interactuar directamente con la subunidad ribosomal 40S o para activar factores de traducción para reclutar la subunidad 40S. Entre los IRES identificados hasta ahora, el del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) de la familia Picornaviridae exhibe una de las eficiencias de traducción más altas y requiere los factores de iniciación eucarióticos (eIF) 4G, 4A, 2 y 3 para reclutar la subunidad 40S para la traducción. iniciación5. Este requisito del EMCV IRES es similar al de algunos IRES celulares eucariotas6,7, lo que sugiere similitudes mecanísticas con sus homólogos eucariotas. El elemento EMCV IRES interactúa directamente con el dominio HEAT1 de eIF4G (eIF4GHEAT1), y esta interacción se mejora aún más cuando eIF4GHEAT1 está en complejo con eIF4A8,9 (Fig. 1a, b). Dentro del EMCV IRES, la región G680-C787, designada como JK-St en este estudio, es responsable de la captura específica de eIF4GHEAT1. Previamente determinamos la estructura de esta región JK-St mediante espectroscopia de RMN en solución9. Está compuesto por dos bucles de tallo (dominios J y K) que se bifurcan desde un tallo base (dominio St) (Fig. 1c). En la unión de tres vías, una secuencia altamente conservada de seis adenosinas forma un bucle de tallo corto, denominado ASL, que interactúa con los dominios J, K y St en la parte de unión. Mediante ensayos bioquímicos, se han informado varios sitios de interacción en JK-St o eIF4GHEAT110,11,12. Aunque, según se informa, eIF4GHEAT1 se une a los ARN celulares13,14, la interacción entre JK-St y eIF4GHEAT1 es más fuerte y más específica de secuencia y/o estructura15, lo que sugiere que JK-St ha evolucionado para capturar específicamente eIF4GHEAT1. Sin embargo, el mecanismo estructural por el cual la región JK-St reconoce específicamente eIF4GHEAT1 sigue siendo en gran medida desconocido. Las proteínas de unión a ARN típicas utilizan interfaces en las que residuos cargados positivamente, como arginina o lisina, y/o residuos aromáticos, como tirosina o fenilalanina, se agrupan y alinean para el reconocimiento específico de las moléculas de ARN diana16,17,18. Sin embargo, eIF4GHEAT1 carece de grupos de dichos residuos12 (Figura 1 complementaria), lo que se corrobora con la predicción de los residuos de unión de ARN en eIF4GHEAT1 a partir de los análisis de estructura y/o secuencia que no identifican ninguna interfaz de unión de ARN19,20. Además, para secuestrar y explotar el sistema traduccional del huésped, el ARN viral IRES debe unirse a eIF4GHEAT1 sin perturbar su función innata en la traducción; es decir, reclutar eIF4A. Para cumplir esta condición, JK-St debe unirse a eIF4GHEAT1 sin competir con eIF4A, lo que restringe aún más los posibles sitios de unión en eIF4GHEAT1.

a Representación esquemática del complejo de iniciación de la traducción formado por EMCV IRES. La región JK-St interactúa directamente con la proteína de andamiaje eIF4G de la célula huésped, lo que conduce al reclutamiento de eIF4A, eIF3, eIF2 y la subunidad ribosomal 40S en el codón de iniciación. Esta figura está adaptada de la ref. 9. b Organización del dominio de la construcción eIF4G completa y eIF4GHEAT1. c Estructura de RMN de JK-St en estado libre9 (PDB ID: 2NBX). d Estructura general del complejo ternario JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A, superpuesta con el mapa de densidad crio-EM filtrado de paso bajo. e Mapa crio-EM enfocado (izquierda) y estructura (derecha) de JK-St/eIF4GHEAT1. Los dominios J, K y St de JK-St están etiquetados junto con el dominio ASL en el cruce. Los iones Mg2+ se muestran como esferas negras. f, g Representaciones de potencial electrostático de la superficie de eIF4GHEAT1 en la interfaz entre el dominio J (f) y el dominio St (g), contorneadas desde –5 kT/e (rojo) a +5 kT/e (azul). Los residuos del JK-St en contacto con el eIF4GHEAT1 se muestran como barras. Las etiquetas de los residuos extruidos, A724 en el dominio J (f) y G777 en el dominio St (g), están resaltadas con cuadros. h Comparación de las orientaciones de los dominios. Las estructuras de JK-St en estado libre y en complejo con eIF4GHEAT1/eIF4A se muestran como representaciones de superficie y de cinta y palo, respectivamente. Los dominios J, K, St y ASL están coloreados en verde, azul, naranja y rojo, respectivamente. Las estructuras están alineadas con el dominio K, y los cambios en las orientaciones de los dominios J y St en formaciones complejas se muestran como flechas negras.

Aquí, analizamos la estructura tridimensional del complejo ternario JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A mediante el uso de microscopía crioelectrónica (crio-EM). La estructura exhibe dos sitios de unión distintos en la región JK-St. Cada uno interactúa con dos hendiduras cargadas negativamente separadas y los parches circundantes cargados positivamente en eIF4GHEAT1, respectivamente, a través de las nucleobases extruidas A724 del dominio J y G777 del dominio St. Es importante destacar que en la estructura analizada en estado libre, estas nucleobases no están volteadas sino apiladas dentro de los tallos, mientras que ambas están volteadas en la estructura compleja ternaria. Además, la orientación relativa de los dominios J y St es bastante diferente a la del estado libre. Realizamos análisis de RMN en solución para investigar las propiedades dinámicas de estos sitios de unión de eIF4GHEAT1. Los resultados demuestran que los dominios J y St utilizan diferentes modos dinámicos: los abultamientos en el dominio J están en equilibrios conformacionales donde A724 en el abultamiento no está en gran medida perturbado, mientras que el dominio St está en equilibrios conformacionales del cambio de registro en concierto con el Dominio ASL, que conduce a la liberación de G777 de la interacción de apilamiento. En el equilibrio conformacional, ASL asume una conformación que lleva los dos sitios de unión a las posiciones óptimas para la unión. Estas dinámicas son importantes para capturar eIF4GHEAT1, ya que la supresión de estas dinámicas por mutaciones anuló las interacciones sin afectar los residuos de unión de eIF4GHEAT1. En conjunto, nuestro estudio destaca el hallazgo de que EMCV IRES ha evolucionado para utilizar los dos dominios de unión eIF4GHEAT1, cada uno de ellos diseñado para los dos pequeños parches de la proteína diana. Estos dos dominios no pueden unirse a la proteína objetivo por sí solos debido a la falta de suficientes interacciones intermoleculares, pero pueden formar un complejo estable cuando se consolidan y ubican en las posiciones óptimas mediante el reordenamiento dinámico del ASL en la unión de tres vías. . Estos conocimientos mecanicistas y funcionales iluminan la elegante estrategia empleada por el ARN viral para capturar la proteína huésped para una replicación eficiente.

En este estudio, utilizamos JK-St (G680-C787 en el ARN del genoma de EMCV), el dominio HEAT1 de eIF4G humano (residuos 746-992), designado como eIF4GHEAT1, y el eIF4A humano de longitud completa. El experimento de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) reveló que JK-St se une a eIF4GHEAT1 con valores de Kd de 0,149 ± 0,012 y 2,07 ± 0,28 μM, en presencia de Mg2+ 2 mM y ausencia de Mg2+, respectivamente (Figuras complementarias 2a, b). ), mostrando la dependencia del Mg2+ de la interacción. Analizamos la estructura del complejo JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A en presencia de Mg2+ con una resolución de 3,8 Å mediante crio-EM (Fig. 1d y Figs. complementarias 2c, 3, 4, 5). En la estructura, los dominios J y St contactan directamente con eIF4GHEAT1, mientras que eIF4A no interactúa con la región JK-St (Fig. 1d). Si bien el mapa crio-EM en la región de JK-St/eIF4GHEAT1 estaba bien resuelto, la región de eIF4A exhibió una densidad EM más débil, especialmente en el lóbulo N-terminal, lo que refleja la flexibilidad de la subunidad (Figura complementaria 4a). Un mayor refinamiento local con una máscara en JK-St/eIF4GHEAT1 produjo el mapa crio-EM enfocado de la región con una resolución de 3,7 Å (Fig. 1e y Fig. complementaria 3). En el dominio J, G702, U703, A704, C705, U722, G723, A724 y U725 interactúan con eIF4GHEAT1 desde el lado del surco menor (Fig. 1f y Fig. complementaria 5b). Todas estas bases, excepto A724, interactúan principalmente con el parche cargado positivamente en eIF4GHEAT1, incluidos los átomos de las cadenas laterales de Arg 840, Lys841, Lys922, Lys925 y Arg954, mientras que la nucleobase de A724 se extruye del tallo para interactuar profundamente con la hendidura cargada negativamente que incluye átomos de cadena lateral de Asp918. En el dominio St, G690, A691, U692, G693, C776, G777, U778 y C779 también interactúan con eIF4GHEAT1 desde el lado del surco menor (Fig. 1g y Fig. complementaria 5c). Todos estos residuos, excepto G777, interactúan principalmente con el parche cargado positivamente en eIF4GHEAT1, incluidos los átomos de las cadenas laterales de Lys826 y Asn838, mientras que la nucleobase de G777 se extruye del tallo para interactuar con otra hendidura cargada negativamente, incluidos los átomos carboxi de la cadena principal de Thr784, Leu786 y Ala824, que difiere del contactado por el dominio J. Según los análisis crio-EM y de estructura de RMN previos, el ángulo entre los dominios del tallo J y St en el complejo JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A está notablemente alterado en comparación con el ángulo formado en el estado libre (Fig. 1h). mientras que las estructuras de eIF4GHEAT1 / eIF4A todavía se parecían a las estructuras de estado libre (Figura complementaria 5a).

Las comparaciones de las estructuras de JK-St en complejo con eIF4GHEAT1 y eIF4A analizadas por crio-EM (Fig. 2a) con las del estado libre analizado por NMR9 (Fig. 2b) revelaron múltiples cambios en las estructuras secundarias (Fig. 2 , fondos grises). En el dominio J en la estructura de estado libre, las bases de unión de eIF4GHEAT1 forman protuberancias y se apilan dentro de la protuberancia; es decir, A700 no tiene pares de bases, A704 tiene pares de bases con U720, C705 con A719 y A724 no tiene pares de bases sino que está apilado dentro del bulto. En la estructura del complejo crio-EM en el estado unido a eIF4GHEAT1, estas bases todavía forman protuberancias con cambios menores en los patrones de emparejamiento de bases no canónicas; es decir, A700 está emparejado con G723, U703 con U720 y A724 está desplegado. Estos cambios de pares de bases ocurren exclusivamente en los bultos que se unen directamente a eIF4GHEAT1.

a La estructura secundaria de JK-St en el complejo con eIF4GHEAT1 y eIF4A, determinada por crio-EM en este estudio. Las bases que no están modeladas se muestran en gris claro. b La estructura secundaria del JK-St en estado libre, determinada por RMN9. Las líneas entre las bases indican los pares de bases canónicos de Watson-Crick, los puntos indican los pares de bases oscilantes y las líneas discontinuas son para pares de bases no canónicos. Los residuos de unión de eIF4GHEAT1 están resaltados con líneas violetas. Los dominios J, K, St y ASL están coloreados en verde, azul, naranja y rojo, respectivamente. Las diferencias entre estas dos estructuras se resaltan con fondos grises.

En marcado contraste, los reordenamientos estructurales ocurren no solo para los sitios de interacción de eIF4G en el dominio St, sino también para aquellos que no están directamente involucrados en la interacción con eIF4GHEAT1 (Fig. 2). En nuestra estructura de estado libre anterior, el dominio ASL forma un bucle de raíz corto, y la raíz superior del dominio St forma cinco pares de bases Watson-Crick o oscilantes consecutivos apilados con un par de bases no canónicas de Ade-Ade; es decir, A688-A781, G689-U780, G690-C779, A691-U778, U692-G777 y G693-C776. En la estructura JK-St en complejo con eIF4GHEAT1/eIF4A, el dominio ASL no forma el tallo-bucle corto, y el tallo superior del dominio St, que incluye el sitio de unión de eIF4GHEAT1, exhibe grandes reordenamientos de pares de bases dentro del bases de dominio ASL; es decir, G686-A781, A687-U780, G689-C779, G690-U778, A691-C776, U692-A774 y G683-A773. G777 está desplegado para interactuar con la hendidura de eIF4GHEAT1. En conjunto, la comparación ilustra que la interacción de la región JK-St con eIF4GHEAT1 implica varios reordenamientos estructurales: el dominio J está perturbado localmente dentro del bulto, mientras que el tallo superior del dominio St se reordena en gran medida con el cambio del dominio ASL. aunque ambos acompañan el despliegue de los residuos de extrusión clave, A724 y G777. Es importante destacar que ambos dominios son necesarios para la unión a eIF4GHEAT1, porque ninguno de los dominios aislados podría unirse a eIF4GHEAT1 (Figuras complementarias 2d, e)9.

Para obtener información sobre el mecanismo subyacente a la captura de la proteína diana del huésped por el ARN viral, utilizamos solución de RMN para caracterizar las propiedades dinámicas de los sitios de unión de eIF4GHEAT1 de JK-St. Con este fin, empleamos el marcaje con isótopos [u-2H, Ade-{1H2, 1H8, 13C8}, Gua-{1H8, 13C8}] de muestras de ARN, y lo usamos en combinación con espectroscopía optimizada de relajación transversal aromática 1H-13C ( TROSY)21 (Figura complementaria 6), que permite la observación de señales de RMN que se reflejan en la estructura y dinámica del ARN con alta sensibilidad. Las señales TROSY aromáticas 1H8-13C8 del dominio J aislado se superpusieron con las del JK-St de longitud completa, lo que corrobora que la estructura del dominio J aislado se conserva como en el JK-St9 de longitud completa (Figura complementaria 7a, b). Los valores de Rex obtenidos del experimento de dispersión de relajación cuántica única (SQ) de 13C, que es la contribución del intercambio químico a la tasa de relajación transversal R2, reflejan el grado de dinámica estructural en la escala de tiempo μs-ms que es crítica para el funcionamiento de muchos ARN22 . Luego, los análisis de Rex del dominio J aislado se realizaron de manera específica de base, en ausencia de eIF4GHEAT1 a 30 °C (Fig. 3a). Como resultado, G701, A704, G718 y G723 exhibieron valores de Rex mayores que 10 s-1, mientras que G702 y A719 no pudieron analizarse cuantitativamente porque sus mayores grados de dinámica obstaculizaron la cuantificación de las intensidades de la señal, lo que indica que las bases son en procesos de intercambio conformacional en una escala de tiempo μs-ms. Estas bases están dentro o adyacentes a las protuberancias en el dominio J que interactúan con eIF4GHEAT1 (Fig. 3a). Es importante destacar que A724, cuya nucleobase se extruye a la hendidura de eIF4GHEAT1 en la estructura compleja, exhibió un valor Rex relativamente pequeño de 3,7 ± 0,2 s-1. Dado que esta base está apilada en el abultamiento con las bases vecinas, G723 y U725, en la estructura de estado libre (Fig. 2b), estos resultados indicaron que A724 esencialmente permanece apilada durante toda la trayectoria de los procesos de intercambio químico. En conjunto, los análisis de Rex del dominio J aislado demostraron que el cambio de la nucleobase A724 no ocurre por sí solo y, por lo tanto, solo puede iniciarse después de que el dominio J se acopla con eIF4GHEAT1.

a Izquierda: valores Rex específicos del residuo del dominio J. Los residuos que no pudieron analizarse cuantitativamente debido a extensos intercambios conformacionales en la escala de tiempo μs-ms se muestran como fondos grises. Medio y derecha: Mapeo de los valores de Rex en la estructura secundaria (medio) y la estructura terciaria del dominio J informado anteriormente (derecha, PDB ID: 2NBY)9. Los residuos de Ade/Gua que exhibieron valores de Rex superiores a 10 s-1 están coloreados en rojo, mientras que aquellos entre 5 y 10 s-1 son cian. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. b Izquierda: valores Rex específicos del residuo del dominio StASL. Los residuos que no pudieron analizarse cuantitativamente debido a extensos intercambios conformacionales en la escala de tiempo μs-ms se muestran con un fondo gris. Centro y derecha: Mapeo de los valores de Rex en la estructura secundaria (centro) y el modelo de estructura terciaria (derecha), que se deriva de la estructura reportada anteriormente del dominio ΔJΔK9 (PDB ID: 2NC1) mediante la sustitución de los tetraloops GAAA con el UUCG. tetrabucles. Los residuos de Ade/Gua que exhibieron valores de Rex superiores a 10 s-1 están coloreados en rojo, mientras que aquellos entre 5 y 10 s-1 son cian. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Las barras de error indican errores experimentales derivados de la relación señal-ruido de cada correlación, como está escrito en Métodos.

Para analizar la dinámica conformacional del sitio de interacción eIF4GHEAT1 en el dominio St, utilizamos una construcción designada como dominio StASL (Fig. 3b), que incluye los dominios St y ASL aislados, debido a que el reordenamiento estructural del dominio St al unirse a eIF4GHEAT1 implica cambios en el dominio ASL (Fig. 2). Las señales aromáticas TROSY 1H8-13C8 de la muestra del dominio StASL aislado se superpusieron con las del JK-St de longitud completa, lo que confirma que la estructura del dominio StASL aislado se conserva como en el JK-St9 de longitud completa (Figura complementaria 7a). , C). Los valores de Rex del dominio StASL se obtuvieron a 30 ° C y se representaron (Fig. 3b). Las nucleobases de A688, G690, A691, G693, A775 y G777 exhibieron valores de Rex mayores que 10 s-1, mientras que las nucleobases de A687, A771, A772, A773 y A774 tuvieron valores de Rex moderados entre 5 y 10 s-1. , lo que indica que las bases se encuentran en procesos de intercambio conformacional en una escala de tiempo μs-ms. G731 no pudo analizarse cuantitativamente porque el gran grado de dinámica obstaculizó la cuantificación de las intensidades de la señal. Curiosamente, G777, cuya nucleobase se extruye en la hendidura de eIF4GHEAT1 en la estructura compleja, mostró el valor Rex más grande de 21,2 ± 2,0 s-1, lo que indica que la base sufre procesos de intercambio químico en la escala de tiempo μs-ms.

Para caracterizar mejor la dinámica observada para el dominio StASL, investigamos la dependencia de la temperatura de las señales aromáticas TROSY 1H8-13C8, que reflejan el cambio en el equilibrio conformacional ante los cambios de temperatura. Todas las bases que exhibieron valores de Rex mayores que 5 s-1 (Fig. 3b), excepto G777, mostraron cambios de desplazamiento químico lineal al reducir la temperatura de 35 °C a 10 °C, mientras que G777 exhibió cambios de desplazamiento químico no lineales. (Figura 4a). Estos resultados indicaron que la mayoría de las bases (excepto G777) existen en equilibrio entre al menos dos estados, mientras que G777 lo hace entre al menos tres, donde las poblaciones de cada estado se perturban con los cambios de temperatura. Luego analizamos los perfiles de dispersión de relajación de 13C SQ del dominio StASL, que son la dependencia de la frecuencia de pulso de RMN (νCPMG) del R2 efectivo, incluida la contribución del intercambio químico, R2,eff. Estos perfiles proporcionan información sobre los procesos de intercambio en términos del tipo de cambio, kex, las poblaciones relativas de los estados que intercambian, p, y la diferencia en el desplazamiento químico, Δω23. El modelo de intercambio rápido de dos estados24 con un tipo de cambio único (18.500 ± 360 s-1) explicó los perfiles de dispersión de relajación 13C SQ de A687, A688, G690, A691, G693, A771, A772, A773, A774 y A775 simultáneamente. lo que demuestra que los intercambios químicos de estos residuos ocurren de manera cooperativa (Fig. 4b, arriba y Fig. complementaria 8). Dado que G777 está en el tallo superior del dominio St, donde se encuentran A688, G690, A691 y G693, G777 también debería experimentar este proceso de intercambio químico. Al utilizar los parámetros de intercambio obtenidos de los análisis de ajuste global mencionados anteriormente, los perfiles de dispersión de relajación 13C SQ de G777 se ajustaron numéricamente al modelo de intercambio de tres estados, donde G777 realiza transiciones entre el estado fundamental (GS) y dos estados excitados distintos 1 y 2 (ES1 y ES2) que no se distinguen como diferencias de desplazamiento químico de las otras bases (Fig. 4b, abajo). Como resultado, obtuvimos un conjunto de parámetros cinéticos y los cambios químicos de 13C de G777 C8 en cada estado (Fig. 4c, Figs. complementarias 9, 10). Las poblaciones de GS, ES1 y ES2 son 80,4 ± 2,9, 17,9 ± 2,9 y 1,7 ± 0,1%, respectivamente, mientras que los valores de desplazamiento químico del átomo C8 de G777 en estos estados son 138,2, 136,6 y 138,5 ppm, respectivamente. , con tipos de cambio de 18.600 ± 120, 410 ± 370 y 230 ± 70 s−1 entre GS y ES1, ES1 y ES2, y GS y ES2, respectivamente. Cabe señalar aquí que los desplazamientos químicos de A687, A688, G690, A691, G693, A771, A772, A773, A774 y A775, que se analizaron con el modelo de intercambio rápido de dos estados, no deberían ser distinguibles entre ES1 y ES2. para cada base, aparentemente reduciendo el modelo de intercambio de tres estados (Fig. 4c) al modelo de intercambio rápido de dos estados. Por lo tanto, el tallo superior St y el dominio ASL se encuentran en el intercambio químico de tres estados entre GS, ES1 y ES2, en el que los cambios químicos de G777 se perturban entre ES1 y ES2.

a Dependencias de la temperatura de las señales TROSY aromáticas 1H8-13C8 de A771 (dominio ASL) y G777 (dominio St). Los espectros adquiridos a 10, 15, 20, 25, 30 y 35 °C en la frecuencia 1H de 1,0 GHz se muestran en marrón, violeta, naranja, rojo, verde y azul, respectivamente. b Ajuste de la curva de dispersión de relajación. Los valores R2,eff obtenidos a 30 °C y en las frecuencias 13C de 250 MHz y 150 MHz (frecuencias 1H de 1,0 GHz y 600 MHz) se muestran mediante puntos rojos y azules, respectivamente. El perfil de dispersión de relajación de G777 se ajustó con el modelo de intercambio de 3 sitios, en el que posee dos cambios químicos diferentes en los estados excitados, utilizando parámetros cinéticos obtenidos del ajuste global con el modelo de intercambio de 2 sitios (ver también la Fig. 8). Las curvas ajustadas se muestran como líneas rojas y azules para las frecuencias 13C de 250 MHz y 150 MHz, respectivamente. Las barras de error indican errores experimentales derivados de la relación señal-ruido de cada correlación, como está escrito en Métodos. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c Arriba: Los parámetros de intercambio obtenidos del perfil de dispersión de relajación a 30 °C. Abajo: Los desplazamientos químicos del 13C8 de G777. Entre los cambios químicos observados, 137,9 ppm es el promedio cinético del estado fundamental (138,2 ppm), el estado excitado 1 (136,6 ppm) y el estado excitado 2 (138,5 ppm). Valores de desplazamiento químico previstos de 13C8 de G777 desde la estructura de hélice en forma de A ideal (137,0 ppm), la estructura de RMN de JK-St en estado libre (138,1 ppm) y la estructura crio-EM de JK-St en complejo con eIF4GHEAT1 (140,6 ppm) se muestran en gris, lo que indica que los cambios químicos de 13C8 reflejan principalmente el apilamiento con el residuo anterior. Tenga en cuenta que los valores de desplazamiento químico previstos se corrigen para las señales TROSY añadiendo 0,5 ppm.

Los desplazamientos químicos del 13C8 de las bases purínicas (adenosina y guanosina) supuestamente se correlacionan con el grado de apilamiento con la base anterior en el lado 5'25,26,27; en este caso, C776. De hecho, un cálculo basado en la distancia28 estimó el desplazamiento químico del 13C8 de una guanosina en la estructura de hélice en forma de A ideal, donde la citosina precedente está completamente apilada sobre la guanosina, en 137,0 ppm, el del G777 en la estructura de RMN en la guanosina. estado libre, donde C776 está solo parcialmente apilado, como 138,1 ppm, y el de G777 de la estructura crio-EM en el complejo, donde G777 se voltea sin interacciones de apilamiento intramolecular, como 140,6 ppm (Fig. 4c). Dado que los desplazamientos químicos del 13C8 de G777 en GS, ES1 y ES2 son 138,2, 136,6 y 138,5 ppm, respectivamente, estos valores ilustran que G777 está más apilado en ES1 y menos apilado en ES2 que en GS (Fig. 4c). De ahora en adelante, nos referiremos a estas conformaciones en ES1, ES2 y GS como conformación excitada (EC) 1, EC2 y conformación fundamental (GC), respectivamente. La GC, que es la conformación más poblada (80,4%) a 30 °C, corresponde a la estructura de RMN9 en la que G777 está parcialmente apilado, como lo corrobora la correspondencia de desplazamiento químico con G777 en GC y el valor calculado a partir de la estructura de RMN. Las conformaciones excitadas poco pobladas no se detectaron en análisis estructurales de RMN anteriores que se centraron en la conformación del suelo más poblada. En este estudio, se observaron estas conformaciones excitadas mediante la realización de análisis de dispersión de relajación por RMN para investigar las propiedades dinámicas de JK-St.

Para aclarar el mecanismo subyacente a los cambios en las interacciones de apilamiento en G777, buscamos caracterizar aún más el equilibrio conformacional observado para el dominio StASL, mediante la estabilización de las conformaciones excitadas. Primero, se diseñó la variante U778C. U778 tiene un par de bases con A691 en la estructura de RMN en estado libre, mientras que forma el par de bases oscilantes de GU con G690 en el complejo con eIF4GHEAT1 (Fig. 2). En el espectro NOESY 1H-1H a 10 °C, donde se observan picos cruzados cuando dos protones imino (1Himino) están en proximidad espacial (<5 Å), solo se observaron picos cruzados entre los protones imino de U780, G689 y G690. para la variante U778C (Fig. 5a). Estos resultados indicaron que los pares de bases A687-U780, G689-C779 y G690-C778 se estabilizan mediante una única sustitución de U por C en la posición 778, posiblemente debido al par de bases desestabilizante A691-U778 Watson-Crick (WC), y la estabilizando el par de bases oscilantes G690-U778 al par de bases del WC del GC (Fig. 5b, Fig. complementaria 11). Este cambio de registro cambia el patrón de emparejamiento de bases del tallo superior de St al observado en el estado unido a eIF4GHEAT1 (Fig. 2, 5b). Luego comparamos las señales TROSY aromáticas 1H8-13C8 de G690, que tiene una base emparejada con C778 en el tallo superior St con registro desplazado. Para el dominio StASL de tipo salvaje, los valores de cambio químico de G690 cambiaron linealmente a medida que la temperatura disminuyó de 35 °C a 10 °C, lo que indica el cambio poblacional del equilibrio conformacional (Fig. 5c). Para la variante U778C del dominio StASL, la señal a 35 °C se observó en la línea extrapolada de los cambios de desplazamiento químico dependientes de la temperatura observados para el tipo salvaje hacia la temperatura más baja, y se desplazó aún más en la línea a medida que la temperatura aumentaba. disminuyó a 10 ° C, donde se adquirió el espectro 1Himino-1Himino NOESY (Fig. 5a). Esto indica que las conformaciones excitadas (EC1 y EC2) en el equilibrio conformacional observado para el tallo superior St coinciden con la conformación de registro desplazado observada para la variante U778, y la población de conformaciones excitadas aumenta al disminuir la temperatura. Dado que G777 no forma un par de bases canónico y estable en esta configuración de registro desplazado, sino que forma un par de bases oscilantes GU en el GC (Fig. 5b), las interacciones de enlace de hidrógeno con la otra hebra del tallo que sostiene la nucleobase de G777 hacia adentro se debilitan, lo que permite que la nucleobase se salga en EC2.

un espectro 1Himino-1Himino NOESY del dominio StASL (rojo) y su variante U778C (negro). Las señales NOE observadas únicamente para la variante U778C se muestran en azul con sus asignaciones. b Estructura secundaria del tallo superior de St, determinada por los experimentos NOESY. c Dependencia de la temperatura de las señales TROSY 1H8-13C8 del dominio StASL (izquierda) y su variante U778C (derecha). Los espectros adquiridos a 10, 15, 20, 25, 30 y 35 °C se muestran en marrón, violeta, naranja, rojo, verde y azul, respectivamente. En los espectros de la variante U778C, la señal se observó en la línea extrapolada (gris) de la construcción parental, lo que indica que el equilibrio se desplazó de modo que las conformaciones que están más pobladas a temperatura más baja están más estabilizadas por la mutación U778C. d Comparación de las perturbaciones de desplazamiento químico dependientes de la temperatura de las señales del dominio ASL con las perturbaciones de desplazamiento químico dependientes de Mg2+. (Izquierda) Perturbaciones de desplazamiento químico dependientes de la temperatura de las señales de ASL en el dominio StASL. Los espectros adquiridos en ausencia de Mg2+ a 25, 30 y 35 °C se muestran en rojo, verde y azul, respectivamente. (Derecha) Perturbaciones de desplazamiento químico dependientes de Mg2+ del dominio ASL en JK-St a 35 °C. Los espectros adquiridos con concentraciones de Mg2+ de 0, 1,2 y 2,5 mM se muestran en azul, naranja y morado, respectivamente. e Comparación estructural del dominio ASL. (Izquierda) Estructura ASL libre de Mg2+ en la estructura JK-St libre (estado fundamental). (Derecha) Estructura de ASL unida a Mg2+ en el estado unido a Mg2+ en el complejo JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A. Las bases en el dominio ASL se muestran en rojo y las involucradas en la interacción con Mg2+ en azul.

Posteriormente realizamos el experimento de dispersión de relajación 13C SQ en la variante StASL U778C (Figura complementaria 12). La señal de G777 C8 se amplió más allá de la detección debido a la introducción de la mutación U778C que posiblemente refleja el cambio en el equilibrio conformacional, lo que la hace no analizable mediante el experimento de dispersión de relajación. Sin embargo, se demostró que las curvas de dispersión de relajación de G687, G690, A771 y A772, que exhibían perfiles lineales en el tipo salvaje (Fig. 4b y Fig. 8 complementaria), mostraban perfiles no lineales en la variante U778C (Suplementaria). Figura 12c). Estas curvas no pudieron ajustarse ni a la ecuación de intercambio rápido de dos estados24 ni a la ecuación general de intercambio de dos estados29, lo que sugiere que la modulación en el equilibrio conformacional alteró el intercambio químico entre GS, ES1 y ES2 evidente para estas bases. El ajuste global de las curvas de dispersión de relajación de estas bases con el modelo de intercambio de tres estados, asumiendo tipos de cambio equivalentes al tipo salvaje, reveló que las poblaciones de GS, ES1 y ES2 son 36,9 ± 3,1, 58,8 ± 2,9 y 4,3. ± 0,1%, respectivamente, para esta variante (Fig. 12d complementaria), que es marcadamente diferente de las poblaciones de 80,4 ± 2,9, 17,9 ± 2,9 y 1,7 ± 0,1% observadas para el tipo salvaje (Fig. 4c). Estos resultados indican cuantitativamente que la mutación U778C disminuye la población de GS mientras aumenta las poblaciones de ES1 y ES2, y respaldan la idea de que el tallo superior del dominio St tiene un registro desplazado en ES1 y ES2.

Para caracterizar la conformación excitada del dominio ASL, comparamos los cambios de desplazamiento químico dependientes de la temperatura con los cambios de desplazamiento químico dependientes de Mg2 + de las bases del dominio ASL (Fig. 5d). Curiosamente, al disminuir la temperatura de 35 °C a 25 °C en ausencia de Mg2+, los valores de desplazamiento químico de A771, A772, A773 y A774 en el dominio StASL exhibieron cambios prácticamente idénticos a los observados para estas bases en JK- St al cambiar las concentraciones de Mg2+ de 0 a 2,5 mM, a 35 °C (Fig. 5d). Por lo tanto, los cambios de desplazamiento químico de las bases en el dominio ASL al disminuir la temperatura son idénticos a los observados al titular Mg2+. Dado que la disminución de la temperatura aumenta la población de la conformación excitada (Fig. 5c), la conformación excitada del dominio ASL debe ser similar a la del dominio ASL en el estado unido a Mg2+. Teniendo en cuenta que dos iones Mg2+ se unen a triples de bases que incluyen las bases del dominio ASL en la estructura crio-EM del complejo (Fig. 5e), estos resultados sugieren que la conformación excitada del dominio ASL sin Mg2+ es similar a la conformación del El dominio ASL se une a Mg2+ en la estructura compleja, preformando los sitios de unión de Mg2+, que se estabilizan aún más tras la unión de Mg2+.

En conjunto, estos resultados indican que las CE del tallo superior St y el dominio ASL tienen características estructurales similares a las del estado unido a eIF4GHEAT1, con la importante observación de que la nucleobase extruida G777 se libera de la interacción de apilamiento dentro del tallo. Dado que el tallo superior St es la región que interactúa directamente con eIF4GHEAT1, y G777 se extruye para interactuar con la hendidura cargada negativamente del mismo, estas conformaciones excitadas, especialmente EC2 en las que G777 no está apilado sobre las otras bases, participan favorablemente en las interacciones. en la etapa inicial del complejo proceso de formación. Además, las conformaciones excitadas del dominio ASL en la unión de tres vías que se asemejan al estado unido a eIF4GHEAT1 deberían reorganizar las orientaciones del dominio a aquellas en la estructura compleja (Figs. 1h, 5e), llevando los dos sitios de unión a eIF4GHEAT1 a Posiciones óptimas para encuadernación simultánea.

A continuación, realizamos experimentos de ITC para investigar si la dinámica conformacional observada para los dos sitios de unión de eIF4GHEAT1 en los dominios J y StASL es crítica para la interacción con eIF4GHEAT1 (Figura complementaria 13). Dado que la mutación U778C aumenta las poblaciones de conformaciones excitadas, que poseen las características estructurales de JK-St como en la estructura compleja, se podría esperar que la variante JK-St U778C tuviera una afinidad similar, o incluso más fuerte, por eIF4GHEAT1 en comparación con el tipo salvaje. Sin embargo, la variante JK-St U778C mostró una afinidad disminuida por eIF4GHEAT1, con un valor de Kd superior a 10 μM, en comparación con 149 ± 12 nM para el tipo salvaje (Figuras complementarias 2a, 13b). Es probable que esto se deba a que U778 está en la interfaz con eIF4GHEAT1 en la estructura compleja (Figs. 1g, 2a y Fig. 14 complementaria), y su mutación podría dar como resultado una disminución de la energía libre al interactuar con eIF4GHEAT1, lo que reduce la afinidad por eIF4GHEAT1. Luego diseñamos las variantes A700C y U780C, para suprimir la dinámica conformacional en los dominios J y StASL observados en los análisis de RMN, respectivamente, sin mutar las bases que interactúan directamente con eIF4GHEAT1 (Figura complementaria 15). Para el dominio J, cambiar A700 a citidina permitiría la formación canónica del par de bases Watson-Crick con G723, lo que suprimiría la plasticidad del abultamiento del dominio J G723-A724 para permitir el cambio conformacional en el proceso de formación del complejo (Figura complementaria .15a, b). Para el dominio StASL, cambiar U780 a una citidina estabilizaría el emparejamiento de bases con G689, ya que el par de bases canónico Watson-Crick GC es más estable que el par de bases oscilantes GU, lo que suprimiría el cambio de registro hacia las conformaciones excitadas requeridas para el cambio conformacional en el proceso de formación complejo (Figura complementaria 15d, e). Los análisis de RMN Rex de estas variantes de dominio aislado revelaron que la dinámica en la escala de tiempo μs-ms se suprime (Figura complementaria 15c, f), mientras que las estructuras secundarias de estos dominios aislados no se ven alteradas por la mutación (Figura complementaria 15a, d ). Los experimentos de ITC revelaron que las variantes A700C y U780C de JK-St poseen afinidades reducidas por eIF4GHEAT1 (Figuras complementarias 13a, b), lo que indica que la supresión de la dinámica conformacional para estabilizar la conformación del suelo da como resultado afinidades disminuidas por eIF4GHEAT1.

Finalmente, buscamos investigar la correlación entre la dinámica y la función biológica de IRES. Con este fin, utilizamos el sistema de traducción libre de células humanas, donde el EMCV IRES se utiliza para iniciar la traducción de una proteína informadora, la β-galactosidasa, al interactuar con los factores de iniciación de la traducción en la célula humana (Figura complementaria 13c). . Como resultado, se demostró que la introducción de mutaciones A700C, U780C o U778C en el EMCV IRES de longitud completa disminuyó los niveles de expresión de proteínas a 86,9 ± 3,2, 89,5 ± 3,4 y 72,3 ± 3,4%, respectivamente, lo que demuestra que la dinámica conformacional observada en los análisis de RMN están relacionados con la función biológica de IRES.

En este estudio, visualizamos la estructura tridimensional del complejo JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A, mediante análisis crio-EM de partículas individuales (Fig. 1 y Figs. Suplementarias 3 y 4). Esta estructura no solo corroboró los informes bioquímicos anteriores sobre los sitios de interacción en JK-St y eIF4GHEAT1 (Figura complementaria 16) 10,11,12, sino que también reveló características clave en las interacciones específicas de residuos y cambios conformacionales de JK-St. , tras la interacción con eIF4GHEAT1. La región JK-St se une a eIF4GHEAT1 a través de dos sitios separados en los dominios J y St. Anteriormente presentamos una estructura SAXS de baja resolución del complejo JK-St y eIF4GHEAT1, y propusimos que los dominios K y St son los dominios de unión de eIF4GHEAT1, asumiendo que JK-St no sufre cambios estructurales al unirse a eIF4GHEAT1 9. Aquí , en la estructura crio-EM con una resolución de 3,7 Å, demostramos claramente que JK-St se une a eIF4GHEAT1 a través de los dominios J y St ajustando sus ángulos relativos para adherirse a la superficie de eIF4GHEAT1 (Fig. 1h), pero sin cambiar significativamente la estructura general de eIF4GHEAT1 (Figura complementaria 5a). Este es un requisito importante para someter la maquinaria traduccional del huésped, ya que la inducción de cambios estructurales que interfieren con las interacciones proteína-proteína, en este caso con eIF4A, afectaría la traducción eficiente de las proteínas virales para la replicación. Para lograr la interacción específica de la proteína objetivo sin interferencia de las interacciones con eIF4A, JK-St debe contactar la superficie de eIF4GHEAT1, que tiene parches cargados positiva y negativamente dispersos y solo unos pocos residuos aromáticos expuestos (Figura complementaria 1). . Esta es una situación totalmente diferente de las interacciones ARN-proteína que involucran proteínas canónicas de unión a ARN16,17,18, que utilizan residuos básicos y aromáticos para formar interfaces que son ideales para las interacciones electrostáticas y de apilamiento π-π con el ARN, una sustancia cargada negativamente. y molécula altamente aromática (Figura 1 complementaria).

EMCV IRES permite esta interacción mediante el uso de dos dominios madre, J y St, cada uno de ellos diseñado para los dos pequeños parches de la proteína objetivo. Es importante destacar que ninguno de estos dominios puede unirse al aislamiento de eIF4GHEAT1 (Figura complementaria 2d, e), posiblemente porque la ganancia de energía obtenida al unir un dominio no es suficiente para formar un complejo estable debido a las interacciones limitadas con el parche pequeño. El dominio J interactúa con una pequeña superficie cargada positivamente con los átomos de la cadena principal y una hendidura cargada negativamente con la nucleobase extruida, A724 (Fig. 1f). Nuestros análisis de dispersión de relajación de 13C SQ revelaron la dinámica conformacional de los abultamientos del dominio J, que están formados por los residuos de unión de eIF4GHEAT1 (Fig. 3a). Esto podría ser importante para adquirir plasticidad que se ajuste a la distribución de carga en la superficie del objetivo. También encontramos que A724 se ve mínimamente perturbado por el equilibrio conformacional en ausencia de eIF4GHEAT1, lo que sugiere que el cambio de la nucleobase ocurre solo después de que se forman las interacciones con las otras bases de unión de eIF4GHEAT1, lo que llevaría a A724 a la posición óptima. interactuar con la hendidura. Mientras tanto, el dominio St se acopla a otro parche cargado positivamente en eIF4GHEAT1, también principalmente a través de los átomos de la cadena principal. En este caso, la nucleobase extruida, G777, interactúa con una hendidura relativamente poco profunda y cargada negativamente (Fig. 1g). Dado que la cavidad en el dominio St formada por la extrusión de G777 se llenó con un residuo de lisina, Lys826, de eIF4GHEAT1 (Figuras complementarias 5c, 14), la extracción de G777 es importante no solo por su interacción directa con eIF4GHEAT1, sino también por también para la formación de la bolsa de unión para este residuo básico. Los experimentos de dispersión de relajación de 13C SQ ilustraron que el tallo superior de St existe en un equilibrio conformacional. En las conformaciones excitadas EC1 y EC2, el vástago superior St tiene un registro desplazado, donde G777 tiene más y menos apilamiento de bases, respectivamente. El cambio de registro y el apilamiento más débil de G777 respaldan la noción de que EC2, que existe en una población baja del 1,7% en ausencia de eIF4GHEAT1 (Fig. 4c), posee características estructurales de la conformación del estado ligado y posiblemente esté involucrado en la paso inicial del complejo proceso de formación.

Los dos dominios de unión de eIF4GHEAT1, J y St, se consolidan mediante la unión de tres vías formada por el dominio ASL. Nuestros experimentos de dispersión de relajación 13C SQ también revelaron que el dominio ASL está en un equilibrio conformacional acoplado con el tallo superior St (Fig. 4b, cy Figs. complementarias 8-10). Una comparación de los cambios químicos reveló que las conformaciones excitadas del dominio ASL en ausencia de Mg2+ y eIF4GHEAT1 son similares a la conformación unida a Mg2+ en ausencia de eIF4GHEAT1 (Fig. 5d, e). Dado que Mg2+ está unido a la región del dominio ASL en el complejo JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A, es posible que esta estructura ASL en el complejo represente la conformación excitada del dominio ASL en ausencia de Mg2+ y eIF4GHEAT1. Esto sugiere que las conformaciones excitadas del dominio ASL en la unión de tres vías llevan los dominios J y St a posiciones apropiadas para el acoplamiento simultáneo a los dos parches en el dominio eIF4GHEAT1, mediante las interacciones intramoleculares con los otros dominios (Fig. 1h, 5e).

En total, la región JK-St utiliza dos sitios de interacción para capturar su proteína objetivo, eIF4G, principalmente cambiando el ángulo entre los dominios del tallo J y St (Figs. 1h, 6). Estos dos sitios interactúan colectivamente en la proteína objetivo y la unión no puede lograrse mediante un solo dominio (Figuras complementarias 2a, d, e). Las regulaciones dinámicas pueden adaptarse para cada sitio de unión en eIF4GHEAT1. Es importante destacar que la orientación relativa de estos dos sitios también debe organizarse con precisión, de modo que puedan interactuar simultáneamente con sus respectivos sitios de unión. Por lo tanto, la estructura y dinámica del dominio ASL en la unión de tres vías, que no interactúa directamente con eIF4GHEAT1, también debería desempeñar un papel fundamental e importante en la interacción al ajustar la orientación relativa y la distancia de estos dos sitios de unión. Prevemos que estos hallazgos sobre la función y el mecanismo del IRES viral facilitarán el diseño de nuevas terapias que prevengan la replicación viral al inhibir las interacciones IRES-proteína huésped.

En JK-St, el dominio J está en equilibrio conformacional entre múltiples conformaciones donde los patrones de emparejamiento de bases en la región de abultamiento son diferentes. Las regiones del tallo en el dominio J no se ven perturbadas en el equilibrio (arriba). Los dominios St y ASL están en el equilibrio conformacional concertado entre la conformación fundamental, la conformación excitada 1 y la conformación excitada 2 (abajo). Por el cambio de registro del tallo superior St y el cambio conformacional en el dominio ASL, la reordenación de la orientación de los dominios J, K y St ocurre en las conformaciones excitadas, de modo que JK-St asume una estructura óptima para el simultáneo. interacción de dos sitios por los dominios J y St, necesaria para la unión de JK-St a eIF4GHEAT1.

Los plásmidos para las reacciones de transcripción de ARN in vitro se construyeron insertando secuencias de ADN amplificadas por PCR que contienen el promotor T7 (TAATACGACTCACTATA), seguido de la secuencia de interés, en pUC19 (Takara 3219) entre los sitios de restricción BamHI y EcoRI, utilizando InFusion reacciones (Takara-Clontech 639648). Las secuencias de ARN fueron: JK-St, 5′-GGGGCUGAAGGAUGCCCAGAAGGUACCCCAUUGUAUGGGAUCUGAUCUGG GGCCUCGGUGCACAUGCUUUACAUGUGUUUAGUCGAGGUUAAAAAACCUUAGGCCCC-3′; Dominio J, 5′-gggCAGAAGGUACCCCAUUGUAUGGGAUCUGAUCUGccc-3′; Dominio StASL, 5′-GGGCUGAAGGAUGCCCAGcuucggCUGGGGCCUCGuucgCGAGGUUAAAAAA CGUCUAGGCCC-3′; y JK-St extendido con St, 5′- gggaaau GGGGCUGAAGGAUGCCCAGAAGGUACCCCAUUGUAUGGGAUCUGAUCUGG GGCCUCGGUGCACAUGCUUUACAUGUGUUUAGUCGAGGUUAAAAAACGUCUAGGCCCCauuuccc −3′, donde los nucleótidos no nativos se muestran en minúsculas.

Los plásmidos para la expresión de las enzimas utilizadas para la preparación de rNTPs marcados isotópicamente se amplificaron a partir del genoma DH5α de Escherichia coli y se insertaron en un vector basado en pET28a(+) (Novagen 69864), donde se incorporaron mutaciones silenciosas para aumentar los niveles de expresión. en la región 5 'no traducida31 y se agregó una etiqueta MQLGHNHNHNHNHNHN en el extremo N de la región traducida, mediante el uso de reacciones inFusion. Las enzimas clonadas fueron ribosa-fosfato pirofosfoquinasa (PRPPS, UniProt P0A717), riboquinasa (RK, UniProt P0A9J6), adenina fosforribosiltransferasa (APRT, UniProt P69503), guanilato quinasa (GMK, UniProt P60546), xantina-guanina fosforribosil transferasa (XGPRT, UniProt P0A9M5), uracilo fosforribosiltransferasa (UPRT, UniProt P0A8F0), uridilato quinasa (UMPK, UniProt P0A7E9) y CTP sintetasa (CTPS, UniProt P0A7E5).

Los clones ORF/cDNA de eIF4G humano (UniProt Q04637) y eIF4A humano (UniProt P60842) se adquirieron de DNAFORM (Yokohama, Japón). La secuencia del dominio HEAT1 (residuos 746-992) de eIF4G se amplificó mediante PCR y se clonó en el vector pCold I (Takara-Clontech 3361) utilizando los sitios de restricción XhoI y SalI. La secuencia completa de eIF4A se amplificó mediante PCR y se clonó mediante una reacción SLiCE en un vector pET28 modificado (Novagen 69864), con una etiqueta de octahistidina N-terminal y un sitio de proteasa 3C de rinovirus humano.

Las secuencias de los cebadores utilizados en la clonación se proporcionan como Datos complementarios 1. Todas las secuencias de los plásmidos construidos han sido confirmadas mediante secuenciación de ADN.

Las células BL21 (DE3) (ThermoFisher Scientific C600003) transformadas con el plásmido con los genes que codifican las enzimas se cultivaron en 200 ml de medio LB que contenía 50 mg/l de kanamicina, durante 16 h a 37 °C. El cultivo se transfirió a 2 l de medio LB que contenía 50 mg/l de kanamicina y el cultivo celular continuó a 37 °C hasta que se alcanzó una DO600 de 2. Luego se indujo la expresión de proteínas añadiendo IPTG hasta una concentración final de 1 mM y el cultivo celular continuó durante 3-4 h. Las células se recogieron mediante centrifugación a 10.150 xg durante 15 minutos y se resuspendieron en 200 ml de tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM y x1 cóctel de inhibidor de proteasa (Nacalai Tesque 03969-21). Las células se rompieron mediante sonicación y se centrifugaron a 14.000 xg durante 30 min. El sobrenadante se aplicó a 10 ml de resina de agarosa Ni-NTA (QIAGEN 30230). La resina se lavó exhaustivamente con 300 ml de tampón que contenía NaPi 50 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM, DTT 1 mM e imidazol 10 mM. Las enzimas se eluyeron de la resina mediante un tampón que contenía NaPi 50 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM, DTT 1 mM e imidazol 300 mM. Luego, las fracciones que contenían las enzimas se combinaron y se dializaron frente a un tampón que contenía NaPi 50 mM (pH 7,4), NaCl 300 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10%. Después de la diálisis, las muestras se concentraron con un filtro Amicon-Ultra15 (corte de 10 kDa, Merck UFC901024) y se añadió glicerol hasta una concentración final del 40%. Luego, las muestras se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

El ATP [{1′, 2′, 3′, 4′, 5′, 5′′}-2H, 13C8] se sintetizó enzimáticamente utilizando D-[1, 2, 3, 4, 5, 5′-2H6 ] ribosa (Omicron Biochemicals RIB-040) y adenina 13C8 (Cambridge Isotope Laboratories CLM-1654-PK) como sustratos, con el sistema de regeneración dATP33. En la reacción, se utilizaron RK, PRPPS y APRT purificados internamente, además de creatina quinasa de músculo de conejo (CK, Roche 10127566001), mioquinasa de músculo de conejo (MK, Sigma-Aldrich M3003) y pirofosfatasa inorgánica termoestable ( TIPP, Biolabs de Nueva Inglaterra M0296L). El [{1′, 2′, 3′, 4′, 5′, 5′′}-2H, 13C8] GTP se sintetizó enzimáticamente utilizando D-[1, 2, 3, 4, 5, 5′-2H6 ] ribosa (Omicron Biochemicals RIB-040) y guanina 13C8 (Cambridge Isotope Laboratories CLM-1019-PK) como sustratos, con el sistema de regeneración dATP33. Se utilizaron RK, PRPPS, XGPRT y GMK purificados internamente además de CK, MK y TIPP en la reacción.

El uracilo deuterado se preparó calentando una mezcla de 150 mg de uracilo en abundancia natural, 15 mg de paladio sobre carbono (Sigma 205680-10 G) y 30 ml de D2O en una atmósfera de H2 a 160 °C durante 24 h34. La reacción se filtró y el disolvente se eliminó por evaporación. El u-2H UTP se sintetizó enzimáticamente utilizando D-[1, 2, 3, 4, 5, 5′-2H6] ribosa (Omicron Biochemicals RIB-040) y el uracilo deuterado como sustratos, con el sistema de regeneración dATP35. Se utilizaron RK, PRPPS, UPRT y UMPK purificados internamente además de CK, MK y TIPP. El u-2H CTP se obtuvo convirtiendo el u-2H UTP con CTPS, utilizando NH4Cl como sustrato35.

Después de la reacción, las muestras se filtraron a través de un Amicon-Ultra 15 (corte de 30 kDa, Merck UFC903024) para eliminar los componentes proteicos, se liofilizaron y se volvieron a disolver en agua. El valor de pH de cada muestra se ajustó a 9-10 antes de la aplicación a la resina en gel Affi-Gel Boronate (Bio-Rad 1536103). La resina se lavó con una solución de hidrogenocarbonato de trietilamonio 1 M (TEAB, FUJIFILM Wako Pure Chemical 208-08385) y los rNTP marcados isotópicamente se eluyeron con agua acidificada con CO2 (pH 4,6). Las fracciones que contenían los rNTP se combinaron, se liofilizaron, se redisolvieron en agua y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.

Los plásmidos para la transcripción de ARN in vitro se utilizaron como plantillas para reacciones de PCR para amplificar las regiones que contienen el promotor T7 y la secuencia de interés. Las secuencias de los cebadores utilizados en la clonación se proporcionan como datos complementarios. Para JK-St y el dominio StASL, los dos nucleótidos terminales 5' del cebador inverso fueron metilados en 2'-O para suprimir la heterogeneidad en los extremos 3' de las transcripciones36. Los productos de la PCR se extrajeron con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se precipitaron con isopropanol. Las muestras de ARN se obtuvieron mediante transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa T7 y el ADN molde amplificado por PCR. Los rNTP marcados isotópicamente se utilizaron para las muestras de ARN marcadas con [u-2H, Ade-{1H2, 1H8, 13C8}, Gua-{1H8, 13C8}]. Después de la transcripción, la reacción se detuvo añadiendo EDTA hasta una concentración final de 25 mM y desnaturalización por calor, y luego se enfrió a temperatura ambiente. Luego, la muestra se concentró mediante un filtro Amicon-Ultra 15 (corte de 3 kDa, Merck UFC900324) y se purificó con geles de poliacrilamida con disco desnaturalizante de urea (National Diagnostics EC-835 y EC-840), utilizando una bomba de medio electroosmótico37. Las fracciones que contenían la muestra de ARN se combinaron y concentraron con filtros Microcep Advance (Pall MCP003C41) y luego se lavaron cinco veces con NaCl 1 M antes de intercambiar el tampón para aplicaciones adicionales.

El eIF4GHEAT1 humano se expresó en la cepa E. coli BL21 (DE3) (Merck 69450) mediante inducción con isopropil β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM, y las células se cultivaron durante 24 h a 15 °C. Las células recolectadas se rompieron mediante sonicación en tampón A (Tris 20 mM, pH 7,5 y glicerol al 10 % (v/v)), que contenía KCl 300 mM, DNasa I 10 μg/ml, PMSF 0,5 mM y un cóctel inhibidor de proteasa completo. tableta (Roche 11697498001). Después de la centrifugación a 70.000 g durante 45 minutos, el sobrenadante se pasó a través de resina de afinidad metálica TALON (Takara-Clontech 635504). La resina se lavó con Tampón A que contenía KCl 800 mM y posteriormente con Tampón A que contenía KCl 100 mM e imidazol 10 mM. La proteína se eluyó con tampón A que contenía KCl 100 mM e imidazol 300 mM. La proteína eIF4GHEAT1 se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna Superdex 75 Incremento 10/300 (Cytiva 29148721), con tampón que contenía HEPES 20 mM, pH 7,5, KCl 150 mM, glicerol al 5 % (v/v), 0,1 mM. EDTA y TDT 2 mM. Las fracciones de los picos agrupadas se concentraron a ~250 μM con un filtro Amicon-Ultra 4 (corte de 3 kDa, Merck UFC800324), se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

El eIF4A humano de longitud completa se expresó en la cepa E. coli BL21 Star (DE3) (Thermo Fisher Scientific C601003), se indujo con IPTG 1 mM y se cultivó durante 4 h a 37 °C. Las células recolectadas se lisaron y la proteína se purificó con resina TALON, como se describió anteriormente. La proteína eluida se dializó frente a tampón de carga Q (Tris 20 mM, pH 7,5, KCl 100 mM, glicerol al 5 % (v/v), EDTA 0,1 mM y DTT 2 mM). La muestra se aplicó a una columna RESOURCE Q de 1 ml (Cytiva 17117701) equilibrada con tampón de carga Q. La proteína eIF4A se eluyó con un gradiente lineal de KCl de 100 mM a 400 mM. Las fracciones de los picos agrupadas se concentraron a ~170 μM con un filtro Amicon-Ultra 4 (corte de 10 kDa, Merck UFC801024), se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Para distinguir inequívocamente el dominio St de los otros dominios J y K en los mapas EM obtenidos y aumentar el tamaño del complejo, se preparó JK-St extendido con St, donde el dominio St se extiende en siete pares de bases, además de JK-St (Figura complementaria 2c). Las muestras de ARN JK-St de tipo salvaje y extendido con St se dializaron contra un tampón que contenía fosfato de potasio 40 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, EDTA 0,2 mM y DTT 5 mM, y se concentraron a ~200 μM. El complejo ternario JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A se formó mezclando el ARN de JK-St con las proteínas eIF4GHEAT1 y eIF4A descongeladas en una relación molar de 1,07:1:1,13. La muestra se mezcló con solución madre de ATP 100x hasta una concentración final de 1 mM, se incubó en hielo durante 10 minutos y luego se aplicó a una columna Superdex 200 Incremento 10/300, equilibrada con tampón que contenía HEPES 20 mM, pH 7,5, KCl 150 mM. , MgCl2 2 mM, ATP 100 μM y DTT 1 mM. La absorbancia a 260 nm de la fracción del pico superior que contenía el complejo fue ~3,2, y se aplicaron alícuotas de 3,5 µl de la fracción a rejillas de Au de malla 300 Quantifoil R1.2/1.3, se secaron durante 3 segundos a 4 °C y se sumergieron. congelado en etano líquido utilizando un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific). Los datos crio-EM iniciales se recopilaron manualmente a 300 kV utilizando un microscopio electrónico JEM-Z300CF (JEOL) equipado con un detector de electrones directo K2 Summit (Gatan) en el modo de conteo de electrones. El tamaño de píxel calibrado fue de 0,98 Å en el nivel de la muestra, y las exposiciones de 8 segundos se fraccionaron en dosis en 40 fotogramas con un flujo de electrones de 8 e-/pix/seg. Se recopilaron datos crio-EM más grandes del complejo que contiene el ARN JK-St extendido con St a 300 kV usando un microscopio electrónico JEM-Z320FHC (JEOL) equipado con un detector de electrones directo K2 Summit en el modo de conteo de electrones, usando SerialEM38. El tamaño de píxel calibrado fue de 0,765 Å en el nivel de la muestra, y las exposiciones de 8 segundos se fraccionaron en dosis en 40 fotogramas con un flujo de electrones de 5 e-/pix/seg.

El procesamiento de imágenes se realizó con RELION-3.139,40. El movimiento de la muestra se corrigió utilizando MotionCor241, los parámetros de la función de transferencia de contraste (CTF) se estimaron utilizando Gctf42 y se descartaron las imágenes que mostraban una contaminación sustancial por hielo, fondos anormales o anillos Thon deficientes. Inicialmente, las partículas se seleccionaron con Gautomatch (https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/) sin plantillas, y luego las partículas seleccionadas se sometieron a una clasificación 2D. Se seleccionaron cinco promedios de clases representativos como plantillas para que Gautotch recoja partículas de todas las micrografías recopiladas en JEM-Z320FHC. Las partículas seleccionadas automáticamente se extrajeron con un cambio de escala de imágenes de 300 × 300 a 100 × 100 píxeles y se sometieron a dos rondas de limpieza de clasificación 2D. Se generó un mapa de referencia inicial en RELION y luego se usó como referencia para la clasificación 3D de las partículas limpiadas en cuatro clases, entre las cuales se seleccionó una y se usó para volver a extraer las partículas correspondientes en imágenes de 200 × 200 píxeles. El refinamiento 3D posterior con simetría C1, refinamiento CTF y pulido bayesiano produjo un mapa con una resolución de 3,8 Å. Un mayor refinamiento 3D mediante alineación local con una máscara en una región mejor ordenada produjo un mapa enfocado con una resolución de 3,7 Å (Figura complementaria 3).

Los modelos crio-EM de eIF4GHEAT1 y eIF4A en el complejo de iniciación de traducción 48S humano (PDB ID: 6ZMW)43 se utilizaron y encajaron en el mapa crio-EM de UCSF Chimera44 sin alterar la configuración heterodimérica. Otros montajes y ajustes se realizaron manualmente en COOT, utilizando el módulo de refinamiento de la cadena con restricciones de distancia autolocales45. UCSF Chimera incorporó manualmente el modelo de RMN de JK-St (PDB ID: 2NBX) 9 en el mapa crio-EM, inicialmente basado en la estructura del dominio J. Debido a los grandes cambios conformacionales en la unión de tres vías y el dominio ASL, los dominios K y St no encajaron bien en la densidad. Por lo tanto, los dos dominios se separaron eliminando los residuos en la región de unión del modelo y luego se ajustaron individualmente a la densidad mediante UCSF Chimera. El modelo se ajustó y perfeccionó manualmente en COOT, y los residuos eliminados se construyeron de novo. Se combinaron los modelos de proteínas y ARN, y se realizaron ciclos iterativos de refinamiento en el espacio real en PHENIX46 con restricciones de estructura secundaria y ajustes manuales en todo el mapa complejo, produciendo el modelo crio-EM del complejo ternario. El modelo final de JK-St/eIF4GHEAT1 se obtuvo mediante un mayor refinamiento en PHENIX al mapa enfocado. Las estadísticas de refinamiento se resumen en la Tabla complementaria 1. Las estructuras se representan utilizando PyMol o UCSF ChimeraX47.

Para los experimentos de RMN, las muestras de ARN se disolvieron en tampón de RMN (NaPi 10 mM (pH 6,4), KCl 10 mM). Luego, las muestras se liofilizaron y se redisolvieron en el mismo volumen de D2O al 99,96% (Cambridge Isotope Laboratories DLM-4-10×0,7). Todos los espectros de RMN se adquirieron con los espectrómetros Bruker Ascend Evo 1,0 GHz, Bruker Avance 900, Bruker Avance 800 y Bruker Avance 600 equipados con una sonda criogénica. Los espectros TROSY aromáticos bidimensionales de 1H-13C se adquirieron mediante transferencia de coherencia selectiva de estado de espín21, en un tiempo no constante. Las asignaciones de las señales 1H8-13C8 HMQC del dominio J han estado disponibles en el Banco de Datos de Resonancia Magnética Biológica (BMRB) con el código de acceso 25997. Las diferencias en los desplazamientos químicos del 13C8 debido a la selección de los componentes TROSY en la dimensión 13C en Se consideran los espectros 1H8-13C8 TROSY para obtener las asignaciones utilizadas en este estudio. Para el dominio StASL, los espectros 1H-1H NOESY en D2O se analizaron consultando nuestro informe anterior para el dominio ΔJΔK9, cuyos desplazamientos químicos están disponibles en el BMRB con el código de acceso 26000. Los valores de desplazamiento químico de las señales 1H8 del ΔJΔK Se utilizaron dominios para asignar señales TROSY aromáticas de 13C8 en el dominio StASL, encontrando señales correspondientes en el espectro de TROSY aromáticas de 1H8-13C8.

Los experimentos de dispersión de relajación cuántica única de 13C se registraron a 30 °C, utilizando una secuencia de pulsos basada en TROSY23 con una modificación de fase en el elemento de inversión selectiva del estado de espín durante el tren de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)48. Los valores de Rex se obtuvieron a la frecuencia 13C de 200 MHz con los períodos de relajación CPMG de tiempo constante establecidos en 30 ms para el dominio StASL y 40 ms para el dominio J, respectivamente. Las frecuencias CPMG, νCPMG, se establecieron en 33,3 y 1500 Hz para el dominio StASL, y en 25 y 1500 Hz para el dominio J. Para los análisis de dispersión de relajación del dominio StASL, los períodos de relajación CPMG de tiempo constante se establecieron en 16 y 30 ms en la frecuencia 13C de 250 y 150 MHz, respectivamente. Los valores de νCPMG variaron entre 62,5 Hz y 2000 Hz y 33,3 Hz y 2000 Hz en la frecuencia 13C de 250 y 150 MHz, respectivamente. Todos los datos fueron procesados ​​con Topspin 4.0.8 (Bruker)

Los valores de las tasas de relajación efectiva medidas en presencia de un tren de pulsos CPMG νCPMG Hz, R2,eff(νCPMG), se obtuvieron utilizando la ecuación. 1, donde I (νCPMG) e I (0) representan las intensidades máximas con y sin el período de relajación T, respectivamente.

Las incertidumbres de R2,eff(νCPMG) [σR2,eff(νCPMG)] se calcularon utilizando la ecuación. (2), donde Δ(νCPMG) representa el nivel de ruido en νCPMG.

Para el ajuste global, las curvas de dispersión de relajación del 13C SQ obtenidas con dos campos magnéticos estáticos se ajustaron simultáneamente a la ecuación de intercambio rápido de 2 estados (Ec. 3)24

donde Φ denota el parámetro de amplitud de dispersión, R2,0 denota la tasa de relajación transversal intrínseca, kex denota el tipo de cambio, Δω denota la diferencia de desplazamiento químico y pB denota la población de estados menores. Los procedimientos de ajuste se realizaron utilizando el algoritmo L-BFGS-B implementado en la función optim en R (versión 4.2.1). Las incertidumbres en los parámetros de intercambio ajustados se estimaron mediante 100 simulaciones jackknife, en las que se eliminaron aleatoriamente dos puntos de cada curva de dispersión de relajación.

Para G777, las curvas de dispersión de relajación de 13C SQ obtenidas con dos campos magnéticos estáticos se ajustaron numéricamente al modelo de intercambio de 3 estados entre las conformaciones A, B y C, donde la conformación A corresponde a la conformación principal en el modelo de 2 estados mencionado anteriormente ( Ecuación 4),

donde M(0) es proporcional al vector [pA, pB, pC]T, \({{{{{{\bf{M}}}}}}}\left(T\right)={\left( {{{{{{\bf{A}}}}}}}_{\pm }{{{{{{\bf{A}}}}}}}_{\mp }{{{{{{ \bf{A}}}}}}}_{\mp }{{{{{{\bf{A}}}}}}}_{\pm }\right)}^{n}{{{{ {{\bf{M}}}}}}}\left(0\right)\), y n es el número de pulsos de 180° en el tren de pulsos CPMG. La matriz A se define de la siguiente manera (Ecs. 5 y 6),

donde kXY denota el tipo de cambio de la conformación X a la conformación Y, R2,0 denota la tasa de relajación transversal intrínseca, τCPMG denota el retraso entre los pulsos de CPMG, ΔωXY denota la diferencia de desplazamiento químico entre las conformaciones X e Y, y pX denota la población de conformación X. El tipo de cambio entre las conformaciones A y B del ajuste global antes mencionado se utilizó como constante en el ajuste. Las incertidumbres en los parámetros de intercambio se estimaron a partir de un conjunto de 100 resultados de los cálculos de ajuste donde se variaron los parámetros iniciales. Los parámetros obtenidos se utilizaron luego en los análisis de forma de línea, confirmando que los parámetros de intercambio ajustados explican las señales observadas experimentalmente.

Antes de todos los experimentos de calorimetría de titulación isotérmica (ITC), el eIF4GHEAT1 y los ARN se disolvieron en tampón ITC (HEPES-NaOH 20 mM, pH 6,5, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM y clorhidrato de Tris (2-carboxietil) fosfina 1 mM). a menos que se indique lo contrario. Para cada experimento de ITC, se midieron los calores de reacción (en µcal s-1) para valoraciones de 2 µl de 150–250 µM de eIF4GHEAT1 en 10–20 µM de ARN a 25 °C, con un Microcal PEAQ-ITC (Malvern). Los datos de titulación se analizaron utilizando el modelo de unión de un sitio del software de análisis MicroCal PEAQ-ITC (Malvern). Los valores de Kd se informan cuando el valor c, que es la relación entre la concentración de ARN y el valor de Kd calculado, es menor que 5. Los valores de error representan el error estándar del ajuste ITC. Los experimentos para la interacción entre el tipo salvaje JK-St y el tipo salvaje eIF4GHEAT1 en presencia de Mg2+ 2 mM se repitieron tres veces con resultados similares. Todos los demás experimentos se repitieron al menos dos veces con resultados similares.

Se prepararon geles PAGE de acrilamida al 12 % usando una solución de acrilamida al 30 %/bis (29:1) en tampón TBE 1x (Tris-HCl 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3). La electroforesis se realizó en tampón TBE 1x a una corriente constante de 10 mA a 4 ° C durante 1,5 h. Después de la electroforesis, el gel se tiñó con una solución Stains-all (Sigma E9379-1G).

Se utilizó un sistema de expresión libre de células humanas (TaKaRa 3281) para la traducción dependiente de IRES acoplada a transcripción de la proteína informadora, β-galactosidasa. La construcción de ADN que contiene EMCV IRES y β-galactosidasa (suministrada como vector de control positivo de TaKaRa 3281) se usó como plantilla para obtener las variantes A700C, U778C y U780C mediante mutagénesis basada en PCR. Estas construcciones de ADN mutadas y de tipo salvaje se utilizaron como plantillas para reacciones de transcripción-traducción de T7 in vitro según las instrucciones del fabricante, a una concentración final de 15 ng/μl, en una escala de reacción de 10 μl. Después de la incubación durante 3 horas a 32 °C, se añadió EDTA hasta la concentración final de 25 mM. La cantidad de β-galactosidasa expresada se cuantificó utilizando el kit de detección de β-galactosidasa luminiscente II (Clontech 631712), según las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se midió con un lector de placas multietiquetas Envision 2104 (PerkinElmer). Los experimentos se repitieron siete veces y se informan los valores medios y el error estándar.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

El mapa de densidad crio-EM y la coordenada atómica correspondiente del complejo JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica y el Banco de datos de proteínas con los códigos de acceso EMD-35041 y 8HUJ, respectivamente. El mapa de densidad crio-EM enfocado y la coordenada atómica correspondiente del complejo JK-St/eIF4GHEAT1 se han depositado con los códigos de acceso EMD-36046 y 8J7R, respectivamente. Otros datos estructurales utilizados en este estudio están disponibles en el Protein Data Bank con los códigos de acceso 2NBX, 2NBY, 2NC1, 6ZMW, 1HU3, 6GC5, 4PMI, 6HTU y 2VSO. Los datos de desplazamiento químico del dominio StASL y J se han depositado en el BMRB con los códigos de acceso 51905 y 51906, respectivamente. Los datos de desplazamiento químico utilizados en este estudio están disponibles en BMRB con los códigos de acceso 25997 y 26000. Las secuencias de proteínas utilizadas en este estudio están disponibles en Uniprot con los códigos de acceso P0A717 (PRPPS), P0A9J6 (RK), P69503 (APRT), P60546 (GMK), P0A9M5 (XGPRT), P0A8F0 (UPRT), P0A7E9 (UMPK), P0A7E5 (CTPS), Q04637 (eIF4G) y P60842 (eIF4A). Los datos originales se proporcionan con este documento.

Los códigos personalizados utilizados para ajustar los datos de dispersión de relajación están disponibles en Zenodo en https://doi.org/10.5281/zenodo.8166504.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) Número de subvención JP21ae0121028 (a IS). Este trabajo también fue apoyado por una subvención para investigación científica (A) con el número de subvención 20H00451 (a YF).

Estos autores contribuyeron igualmente: Shunsuke Imai, Hiroshi Suzuki.

Centro RIKEN para la Investigación de la Dinámica de Biosistemas, Tsurumi-ku, Yokohama, 230-0045, Japón

Shunsuke Imai y Ichio Shimada

Laboratorio de Fisiología Celular y Estructural (CeSPL), Universidad Médica y Dental de Tokio, Bunkyo-ku, Tokio, 113-8510, Japón

Hiroshi Suzuki y Yoshinori Fujiyoshi

Escuela de Graduados en Ciencias Integradas para la Vida, Universidad de Hiroshima, Higashi-Hiroshima, 739-8528, Japón

Ichio Shimada

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SI, HS, YF e IS diseñaron la investigación. SI preparó las muestras de ARN, realizó experimentos de ITC y RMN. HS preparó las muestras de proteínas y realizó experimentos crio-EM. SI, HS, YF e IS analizaron los datos y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Shunsuke Imai o Ichio Shimada.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Israel Fernández y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Imai, S., Suzuki, H., Fujiyoshi, Y. et al. Interacción de dos sitios regulada dinámicamente del ARN viral para capturar el factor de iniciación de la traducción del huésped. Nat Comuna 14, 4977 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40582-6

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Recibido: 01 de febrero de 2023

Aceptado: 27 de julio de 2023

Publicado: 28 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40582-6

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